PMEPA1在胰腺癌中的表達(dá)及對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景：
　　胰腺癌發(fā)病隱匿，預(yù)后極差，是致死率最高的惡性腫瘤之一。在我國，胰腺癌的發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第9位，死亡率居第7位，其5年生存率僅為5％左右。除了早期根治性手術(shù)治療，目前尚無其他有效的治療方法。因此，深入探索胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)記物，對胰腺癌的治療有重要的意義。
　　前列腺跨膜雄激素誘導(dǎo)蛋白1(prostate transmembrane protein，androgen i

2、nduced1，PMEPA1)，又稱實(shí)體瘤相關(guān)基因1，是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)蛋白編碼基因。研究顯示:PMEPA1在乳腺癌、肺癌和前列腺癌等惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，能通過轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、雄激素受體、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、缺氧等信號通路，參與惡性腫瘤細(xì)

3、胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，并與腫瘤的預(yù)后相關(guān)。然而，PMEPA1在胰腺癌中的表達(dá)情況及其在胰腺癌中的作用尚未明確。
　　目的：
　　明確PMEPA1在胰腺癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理學(xué)指標(biāo)和預(yù)后的相關(guān)性;研究PMEPA1異常表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;探討胰腺癌細(xì)胞中PMEPA1與PTEN/Akt通路的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.1)收集15對胰腺癌組織及其配對癌旁組織，檢測胰腺癌及癌

4、旁組織中PMEPA1mRNA水平;
　　2)收集74對胰腺癌組織及其配對癌旁組織，以及18例胰腺癌組織，應(yīng)用免疫組化染色檢測PMEPA1蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況;
　　3)統(tǒng)計(jì)臨床病理資料，應(yīng)用Pearson x2檢驗(yàn)分析胰腺癌中PMEPA1表達(dá)與胰腺癌病人的臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系;
　　4)應(yīng)用Kaplan-Meier法及Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析胰腺癌中PMEPA1表達(dá)與胰腺癌病人術(shù)后生存的相關(guān)性。

5、
　　2.1)通過Western blot方法檢測胰腺癌細(xì)胞株與胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中PMEPA1蛋白的表達(dá)情況;
　　2)構(gòu)建慢病毒shRNA載體和PMEPA1表達(dá)載體，對胰腺癌細(xì)胞中PMEPA1基因進(jìn)行敲減和過表達(dá)，篩選穩(wěn)定表達(dá)shRNA和PMEPA1過表達(dá)序列的胰腺癌細(xì)胞;
　　3)通過CCK-8、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，檢測PMEPA1表達(dá)改變對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響;
　　4)通過Trans

6、well細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測PMEPA1表達(dá)改變對胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　3.1)通過Western blot方法檢測PMEPA1過表達(dá)后以及轉(zhuǎn)染PTEN表達(dá)載體后，胰腺癌細(xì)胞PTEN/Akt通路中PTEN、Akt、pAkt、p27kip1、Cyclin D1蛋白的變化;
　　2)通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測PMEPA1過表達(dá)后以及轉(zhuǎn)染PTEN表達(dá)載體后，胰腺癌細(xì)胞增殖活力的變化;
　　3)通過qPCR

7、方法檢測PMEPA1過表達(dá)后以及轉(zhuǎn)染PTEN表達(dá)載體后，胰腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)記物的變化。
　　結(jié)果：
　　1.1)胰腺癌組織中PMEPA1的mRNA水平顯著高于配對癌旁組織（P＜0.001）;2)免疫組化顯示:PMEPA1蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi);胰腺癌組織中高表達(dá)PMEPA1蛋白的比例顯著高于其配對癌旁組織(63.51％vs.10.81％，P＜0.001);
　　3)PMEPA1蛋白的表達(dá)水平與

8、胰腺癌的組織學(xué)分級（x2=4.552，P=0.033）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（x2=5.902，P=0.015）相關(guān);
　　4)Cox回歸多因素分析顯示:PMEPA1高表達(dá)(HR=1.956，P=0.015)是胰腺癌病人術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;
　　5)PMEPA1蛋白高表達(dá)的病人的生存時(shí)間顯著短于PMEPA1蛋白低表達(dá)的病人（中位生存期:7.7個(gè)月vs.23個(gè)月），生存時(shí)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2==6.979，P=0.008)。

9、>　　2.1)PMEPA1蛋白在人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1，BxPC-3，CFPAC-1，SW1990中的表達(dá)水平高于人胰管上皮細(xì)胞株HPDE6-c7;
　　2)與陰性對照組和空白對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向PMEPA1shRNA的細(xì)胞中PMEPA1蛋白表達(dá)減少，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PMEPA1表達(dá)序列的細(xì)胞中PMEPA1蛋白表達(dá)增加;
　　3)與陰性對照組相比，過表達(dá)PMEPA1的BxPC-3細(xì)胞的增殖活力提高(P＜0.001)、克隆形成

10、數(shù)目增加（P＜0.001）、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)中穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.01）;
　　4)與陰性對照組相比，敲減PMEPA1的AsPC-1細(xì)胞的增殖活力降低(P＜0.001)、克隆形成數(shù)目減少（P＜0.01）、裸鼠皮下成瘤的速度減慢（P＜0.001）、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)中穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.01）。
　　3.1)與陰性對照組相比，過表達(dá)PMEPA1的BxPC-3細(xì)胞的P

11、TEN蛋白表達(dá)減少，磷酸化Akt表達(dá)增加，總Akt蛋白表達(dá)無明顯改變;Akt信號下游的細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)增加，p27kip1表達(dá)減少;轉(zhuǎn)染PTEN表達(dá)載體后，過表達(dá)PMEPA1的BxPC-3細(xì)胞中磷酸化Akt表達(dá)減少，細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)減少，p27kip1表達(dá)增加;
　　2)過表達(dá)PMEPA1的BxPC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTEN表達(dá)載體后，細(xì)胞增殖活力降低(P＜0.001)。
　　3)與陰性對照組相比，PMEPA1過表達(dá)后，S

12、nail、N-cadherin和Vimentin的mRNA水平升高，E-cadherin的mRNA水平下降(P＜0.001);PMEPA1過表達(dá)并轉(zhuǎn)染PTEN表達(dá)載體后，Snail、N-cadherin和Vimentin的mRNA水平降低，E-cadherin的mRNA水平升高（P＜0.001）。
　　結(jié)論：
　　1.PMEPA1在胰腺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織;PMEPA1高表達(dá)與胰腺癌組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是胰腺癌病