N-硬脂酰酪氨酸介導內源性大麻素失活系統(tǒng)的神經保護作用及其機制研究.pdf

1、自上個世紀90年代初期發(fā)現(xiàn)了內源性大麻素系統(tǒng)以來，目前被證實的內源性大麻素有N-花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酰甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)，它們通過作用于大麻素受體CB1和CB2發(fā)揮生物活性。大量研究表明，內源性大麻素具有神經保護活性，因此內源性大麻素作用的內源性大麻素系統(tǒng)被認為是新型神經保護藥物的靶點。近年來，內源性大麻素的失活系統(tǒng)逐漸成為上述研究的新熱點。
　

2、　在前期工作中，我們合成了一系列結構與AEA相似的脂氨基酸類化合物，研究中我們通過大鼠離體腦片的缺氧缺糖損傷和原代皮層神經元的損傷實驗篩選出了具有良好的神經保護作用的N-硬脂酰酪氨酸(N-stearoyltyrosine，NsTyr)。本研究以NsTyr為研究對象，采用SD大鼠原代神經元Aβ?lián)p傷模型和OGD損傷模型探討其神經保護活性以及其通過內源性大麻素失活系統(tǒng)介導的神經保護的機制。
　　第一章 N-硬脂酰酪氨酸對抗Aβ?lián)p傷和OG

3、D損傷的神經保護作用
　　β淀粉樣蛋白(Aβ)被認為是阿爾茨海默癥的主要致病原因，缺血再灌注是腦卒中損傷及其炎癥反應和氧化損傷的主要原因。由于缺乏有效的防治方法和手段，使得阿爾茨海默癥和腦卒中影響著人們的生活質量，并造成了社會經濟負擔。
　　本研究采用了SD大鼠皮層神經元建立Aβ?lián)p傷模型和OGD損傷模型，評價了NsTyr的抗Aβ毒性和抗OGD損傷神經元的神經保護作用。我們采用10μg/mL Aβ(1-40)片段建立Aβ?lián)p傷模

4、型;采用缺氧缺糖1h恢復培養(yǎng)24 h的處理流程建立OGD損傷模型。通過MTT檢測和LDH檢測，我們發(fā)現(xiàn)1-20μmol/L NsTyr對Aβ?lián)p傷和OGD損傷的原代皮層神經元具有保護作用，10μmol/L NsTyr對Aβ?lián)p傷和OGD損傷誘導的神經元損傷的保護作用最強;結果還驗證了AEA直接給藥的局限性。Western Blot檢測表明NsTyr可以上調神經元中大麻素受體CB1的表達，進一步提示了NsTyr的神經保護作用與內源性大麻素系統(tǒng)

5、有關。
　　第二章 N-硬臘酰酪氨酸通過抗凋亡途徑對抗Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經保護作用
　　內源性大麻素的神經保護作用及其本身作為神經保護藥物局限性的報道促使人們把研究重點放在尋找內源性大麻素介導的高效低毒神經保護劑上。
　　本文研究通過Hoechst33342染色和TUNEL熒光染色發(fā)現(xiàn)Aβ和OGD誘導的神經元損傷是通過凋亡途徑實現(xiàn)的，而NsTyr確能有效抑制這兩種損傷模型的神經元凋亡。在損傷后和NsTyr處理后，

6、采用Western Blot檢測促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，結果表明NsTyr可以下調損傷引起的Bax表達升高，并可上調損傷引起的Bcl-2表達降低。同樣觀察到NsTyr可以通過上調ERK的磷酸化達到抑制損傷誘導的細胞凋亡的作用。這些結果表明NsTyr通過抗凋亡途徑發(fā)揮對抗Aβ?lián)p傷和抗OGD損傷的神經保護作用。通過MTT檢測、LDH檢測和Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)CB1阻斷劑AM251能逆轉NsTyr對Aβ?lián)p傷

7、和OGD損傷的保護作用，這進一步提示了NsTyr是通過內源性大麻素系統(tǒng)發(fā)揮神經保護作用的。
　　我們前期研究中得到NsTyr與CB1沒有親和力的結果，提示NsTyr不是通過與CB1結合激動大麻素信號通路發(fā)揮神經保護作用的，本章證明NsTyr是通過抗凋亡途徑實現(xiàn)神經保護作用的，這些結果凸顯了揭示NsTyr通過內源性大麻素系統(tǒng)發(fā)揮抗凋亡的作用機制的理論和應用價值。
　　第三章 N-硬脂酰酪氨酸通過介導內源性大麻素失活系統(tǒng)對抗Aβ

8、損傷和OGD損傷誘導的神經保護作用
　　脂氨基酸能抑制AEA水解酶FAAH活性的報道，促使我們研究NsTyr對FAAH的抑制作用。
　　為了明確NsTyr對FAAH的直接抑制作用，我們通過熒光底物檢測，證明NsTyr是通過抑制FAAH的活性(IC50=16.54 nmol/L)，發(fā)揮其對Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經保護作用。Western Blot實驗結果表明NsTyr可以下調Aβ?lián)p傷和OGD損傷導致的FAAH表達的升高，提示

9、NsTyr具有蛋白水平對FAAH表達的抑制作用;而對FAAH mRNA的檢測表明，NsTyr也具有mRNA水平對FAAH表達的抑制作用。這些結果表明，NsTyr通過多種途徑抑制FAAH的活性，實現(xiàn)其神經保護作用。為了進一步明確NsTyr對FAAH的抑制作用，我們應用了非選擇性FAAH抑制劑LY2183240和選擇性FAAH抑制劑URB597，對比評價分別應用抑制劑及NsTyr對Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經保護作用和對AEA失活途徑的抑制作

10、用。檢測細胞存活率、凋亡細胞計數(shù)、檢測Bcl-2、Bax及pERK蛋白表達的實驗結果都表明，與URB597不同，NsTyr和LY2183240都在抑制FAAH活性的同時，阻斷AMT的功能。由于LY2183240是AMT阻斷劑，我們進一步考察了NsTyr對AMT的直接作用。應用3H放射性同位素檢測，發(fā)現(xiàn)NsTyr也能通過阻斷AEA膜轉運體的轉運功能(IC50=11.74 nmol/L)發(fā)揮其對Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經保護作用。實驗結果表

11、明NsTyr可以下調由Aβ?lián)p傷和OGD損傷導致的AMT上游分子iNOS表達的升高和NO總量的增加。對iNOS的mRNA的檢測也進一步確認了這一結論。我們的實驗結果表明了NsTyr既是FAAH抑制劑也是AEA轉運體AMT的阻斷劑。
　　本研究首次明確了NsTyr抑制內源性大麻素失活系統(tǒng)發(fā)揮對抗Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經保護作用。這一結果進一步豐富了NsTyr的神經保護作用的理論依據(jù)，也為了NsTyr作為內源性大麻素失活系統(tǒng)抑制劑的先