內(nèi)源性大麻素在遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血耐受中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：缺血再灌注損傷是引起胸主動(dòng)脈及脊柱手術(shù)后發(fā)生截癱的最主要原因。隨著大量新技術(shù)的應(yīng)用，此類手術(shù)術(shù)后并發(fā)癥已經(jīng)大大降低，但是近期的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，其發(fā)病率仍然超過(guò)了10％。因此如何預(yù)防胸主動(dòng)脈及脊柱手術(shù)后的缺血再灌注損傷，仍然是個(gè)值得關(guān)注的課題。遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理是指，在耐受缺血能力較強(qiáng)的器官誘導(dǎo)短暫缺血，使得重要臟器產(chǎn)生缺血耐受的預(yù)處理方式，多選擇肢體作為誘導(dǎo)器官。由于其安全，容易被患者和醫(yī)生所接受，因此其臨床應(yīng)用前景巨大。近來(lái)研究表

2、明，內(nèi)源性大麻素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面扮演著重要角色，并且參與了缺血預(yù)處理的發(fā)生機(jī)制。泛素系統(tǒng)功能異常是導(dǎo)致神經(jīng)元延遲死亡的重要原因。脊髓缺血損傷后泛素早期的持續(xù)表達(dá)增加，被證實(shí)與脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺血易感性相關(guān)。本研究旨在探討遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對(duì)脊髓缺血損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理直接應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理在誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血耐受中的作用
　　目的：探討肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理在誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血

3、耐受中的作用，為進(jìn)一步機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：采用Fogarty導(dǎo)管阻斷胸主動(dòng)脈血流合并系統(tǒng)低血壓（放血）的方法，制作大鼠脊髓缺血模型。暴露右側(cè)股動(dòng)脈，在股動(dòng)脈分叉以上處阻斷/開(kāi)放，進(jìn)行肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理。雄性SD大鼠40只（300～350g），隨機(jī)分為5組（n=8）：假手術(shù)組，大鼠接受和其它組動(dòng)物一樣的手術(shù)操作包括置管及麻醉，但不誘導(dǎo)脊髓缺血及遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理；單純?nèi)毖獙?duì)照組，1～2％異氟醚麻醉60min，暴露右側(cè)股動(dòng)脈，誘

4、導(dǎo)脊髓缺血12min；遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理2min組，暴露右側(cè)股動(dòng)脈，阻斷/開(kāi)放（預(yù)處理）3個(gè)循環(huán)，每次為2min阻斷/2min開(kāi)放，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理30min后，誘導(dǎo)脊髓缺血12min；遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理3min組，暴露右側(cè)股動(dòng)脈，在股動(dòng)脈分叉以上處阻斷/開(kāi)放（預(yù)處理）3個(gè)循環(huán)，每次為3min阻斷/3min開(kāi)放，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理30min后，誘導(dǎo)脊髓缺血12min。遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理5min組，暴露右側(cè)股動(dòng)脈，在股動(dòng)脈分叉以上處阻斷/開(kāi)放（預(yù)處理）3個(gè)

5、循環(huán)，每次為5min阻斷/5min開(kāi)放，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理30min后，誘導(dǎo)脊髓缺血12min。再灌注24h、48h，由一不了解分組情況的觀察者，評(píng)估并記錄運(yùn)動(dòng)缺陷評(píng)分。評(píng)分方法：
　　a)后肢行走：0分正常；1分行走時(shí)腳趾在肢體下伸展；2分趾關(guān)節(jié)行走；3分靠后肢挪動(dòng)身體，但是無(wú)下肢行走；4分無(wú)行走并且后肢無(wú)運(yùn)動(dòng)。
　　b)放置/踱步反射：0分正常；1分反應(yīng)弱；2分無(wú)踱步反射。每只動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)缺陷評(píng)分（MDI）為得分a+b。

6、>　　總分6分表示完全癱瘓，0分為功能正常。評(píng)分完畢后，截取腰段脊髓組織(L4～L6)，行HE染色。光鏡下觀察HE染色結(jié)果并對(duì)脊髓前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.生理學(xué)參數(shù)：脊髓缺血模型制作過(guò)程中缺血組間血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（PMAP、DMAP、HR），直腸溫度，pH、PaO2、PCO2及血糖變化在各組間均無(wú)明顯差異。脊髓缺血期間，各組遠(yuǎn)端平均動(dòng)脈壓力（DMAP）均維持在DMAP<5mmHg，證實(shí)導(dǎo)管阻斷合并系統(tǒng)低血壓的

7、方法制作大鼠的脊髓缺血模型阻斷確實(shí)，缺血效果可靠。缺血組近端動(dòng)脈壓（PMAP），在脊髓缺血1min內(nèi)均由90mmHg降至45mmHg，表明各缺血組在系統(tǒng)低血壓的產(chǎn)生時(shí)間及水平上保持一致。4個(gè)缺血組大鼠，在脊髓缺血期間，都表現(xiàn)為心率下降，低于缺血前，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是組間沒(méi)有差異。再灌注后5分鐘之內(nèi)，HR、血壓，都可以恢復(fù)到缺血前水平，且缺血組間沒(méi)有差別。缺血組再灌注后血糖高于缺血前（p<0.05），pH低于缺血前（p<0.05），整個(gè)手

8、術(shù)中未出現(xiàn)低氧及二氧化碳潴留。手術(shù)過(guò)程中，直腸溫度維持在37.2°C～37.5°C之間。各組動(dòng)物體重，放血量沒(méi)有差異。假手術(shù)組動(dòng)物各項(xiàng)生理學(xué)參數(shù)在整個(gè)手術(shù)操作過(guò)程中保持穩(wěn)定。
　　2.運(yùn)動(dòng)缺陷評(píng)分(MDI)：再灌注24h、48h，分別對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行運(yùn)動(dòng)缺陷評(píng)分。假手術(shù)組沒(méi)有神經(jīng)功能改變。預(yù)處理3min3個(gè)循環(huán)組，MDI低于對(duì)照組及其它兩組(P<0.01)，表明運(yùn)動(dòng)功能好于其它3組。單純?nèi)毖獙?duì)照組、預(yù)處理2min組、預(yù)處理5min組

9、MDI沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)：在假手術(shù)組，未見(jiàn)損傷神經(jīng)元。預(yù)處理3min3個(gè)循環(huán)組，前角正常神經(jīng)元數(shù)量多于其它三個(gè)缺血組，包括對(duì)照組、預(yù)處理2min組及預(yù)處理5min組(P<0.01)。對(duì)照組、預(yù)處理2min組及預(yù)處理5min組之間，前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：短暫下肢遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)大鼠脊髓的缺血耐受。
　　實(shí)驗(yàn)二大麻素受體在遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血耐受中的作用機(jī)理研

10、究
　　目的：探討大麻素受體拮抗劑對(duì)遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)脊髓缺血耐受的影響，初步證明內(nèi)源性大麻素在遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血耐受的作用機(jī)制。
　　方法：雄性SD大鼠64只，隨機(jī)分為8組（n=8）。預(yù)處理方案為：3個(gè)循環(huán)，每次為3min阻斷/3min開(kāi)放（預(yù)處理方案根據(jù)實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果制定）。分組：
　?、賳渭?nèi)毖獙?duì)照組；
　?、谶h(yuǎn)程缺血預(yù)處理組；
　?、圻h(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM251組，每次預(yù)處理15min前靜脈

11、注射大麻素受體1（CB1）拮抗劑AM251（1mg/kg體重）；
　?、苓h(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM630組，每次預(yù)處理15min前靜脈注射大麻素受體2（CB2）拮抗劑AM630（1mg/kg體重）；
　　⑤遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理+溶劑組；
　?、轆M251組，每次麻醉前15min靜脈注射AM251（1mg/kg體重）；
　?、逜M630組：每次麻醉前15min靜脈注射AM630（1mg/kg體重）；
　　⑧溶劑組：每次麻

12、醉前15min靜脈注射大麻素受體拮抗劑溶劑（1ml/kg體重）。
　　所有組動(dòng)物均接受脊髓缺血損傷，其方法如前所述。再灌注24h、48h，由一不了解分組情況的觀察者，評(píng)估并記錄運(yùn)動(dòng)缺陷評(píng)分。評(píng)分完畢后，截取腰段脊髓組織(L4～L6)，行HE染色。光鏡下觀察HE染色結(jié)果并對(duì)脊髓前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.生理學(xué)參數(shù)：各組未見(jiàn)差異。
　　2.運(yùn)動(dòng)缺陷評(píng)分(MDI)遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組MDI低于單純?nèi)毖獙?duì)照組

13、，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM251組，（P<0.05）。遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組與RIPC+AM630組，及遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理+Vehicle組，MDI無(wú)差別。單純?nèi)毖獙?duì)照組，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM251組，AM251組，AM630組，Vehicle組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)：遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組前角正常神經(jīng)元數(shù)量多于單純?nèi)毖獙?duì)照組和預(yù)處理+AM251組（P<0.05）。遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組與遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM630組，及遠(yuǎn)程缺血預(yù)

14、處理+Vehicle組前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)無(wú)差別。單純?nèi)毖獙?duì)照組，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM251組，AM251組，AM630組，溶劑組之間前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：CB1受體拮抗劑逆轉(zhuǎn)了遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的脊髓缺血耐受，表明CB1受體介導(dǎo)了遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)脊髓缺血耐受的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)三遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)脊髓缺血耐受過(guò)程中內(nèi)源性大麻素含量的變化
　　目的：探討遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)脊髓缺血耐受過(guò)程中內(nèi)源性大

15、麻素含量的變化。
　　方法：雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為2組（n=12）：
　?、偃毖獙?duì)照組。
　?、陬A(yù)處理組。
　　在缺血前即刻，以及缺血再灌注后1h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，截取腰段脊髓組織(L4～L6)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取動(dòng)物數(shù)量為6只。提取內(nèi)源性大麻素并利用液相質(zhì)譜儀（HPLC/MS）檢測(cè)內(nèi)源性大麻素AEA和2-AG的含量。
　　結(jié)果：
　　1.生理學(xué)參數(shù)：生理學(xué)參數(shù)各組未見(jiàn)差異。
　　2.腰段脊髓AEA和

16、2-AG的含量變化：缺血前，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組脊髓節(jié)段內(nèi)AEA含量要高于缺血對(duì)照組(p<0.05)。缺血后兩組間AEA含量并未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單純?nèi)毖獙?duì)照組，缺血后AEA含量高于缺血前(p<0.05)。兩組2-AG的濃度則在缺血前和缺血后均未見(jiàn)明顯變化。
　　結(jié)論：遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)脊髓節(jié)段內(nèi)內(nèi)源性大麻素AEA在脊髓缺血前釋放增加，起到誘導(dǎo)脊髓缺血耐受的作用。
　　實(shí)驗(yàn)四遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血后泛素化的調(diào)節(jié)及內(nèi)源性大麻

17、素的作用
　　目的：探討遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血后泛素化的調(diào)節(jié)及內(nèi)源性大麻素在此過(guò)程中的作用。
　　方法：雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組（n=8）：
　?、賳渭?nèi)毖獙?duì)照組；
　　②遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組；
　?、圻h(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM251組。
　　缺血再灌注后3h，及24h，組織灌注，并截取腰段脊髓組織(L4～L6)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物數(shù)量為4只，制作冰凍切片。行免疫組織化學(xué)染色觀察脊髓前角泛素的表達(dá)及T

18、UNEL染色。免疫組化切片利用image pro plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度值，分析結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.泛素在脊髓前角的表達(dá)：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，泛素在脊髓前角的神經(jīng)元內(nèi)有表達(dá)，染色陽(yáng)性信號(hào)為淡蘭色顆粒，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)點(diǎn)計(jì)算其平均光密度值，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組3小時(shí)的泛素表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P<0.001），和遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM251組（P<0.01）；再灌注24h后，遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組泛素表達(dá)明顯

19、低于對(duì)照組（P<0.01），和遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理+AM251組（P<0.01）。
　　2.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：在缺血再灌注后3h（早期），各組均未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。
　　結(jié)論：遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理可以抑制脊髓缺血后早期的泛素表達(dá)，其原因與遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)源性大麻素釋放，減輕脊髓損傷有關(guān)。脊髓缺血后泛素的表達(dá)明顯早于細(xì)胞凋亡發(fā)生的時(shí)間。
　　小結(jié)：
　　1.短暫下肢遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)大鼠脊髓的缺血耐受。
　　2.內(nèi)源性大麻