內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在兔頸動(dòng)脈外膜損傷致粥樣硬化病變中作用.pdf

1、研究背景和目的： 對于動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)機(jī)制的研究一直是心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究表明動(dòng)脈粥樣硬化是多種因素相互作用的結(jié)果，炎性細(xì)胞和炎癥因子參與其發(fā)生發(fā)展的全過程。 近年來動(dòng)脈外膜在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用日益受到重視，陸續(xù)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)外膜炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)和晚期病變的特征，因此通過干預(yù)外膜可能復(fù)制出穩(wěn)定可行的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。 內(nèi)源性大麻素是一類體內(nèi)細(xì)胞分泌的與大

2、麻有效提取物四氫大麻酚具有類似生物學(xué)效應(yīng)的類脂質(zhì)物質(zhì)，在體內(nèi)外可發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用，和與之特異結(jié)合的大麻素受體、對內(nèi)源性大麻素降解、轉(zhuǎn)運(yùn)的酶類共同構(gòu)成內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)四氫大麻酚通過激動(dòng)大麻素受體具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，而內(nèi)源性大麻素在體內(nèi)外具有抑制平滑肌增殖、炎性細(xì)胞趨化、遷移、凋亡等作用，可能對動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中各個(gè)階段產(chǎn)生影響。因此內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中可能具有調(diào)節(jié)作用，但在體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過

3、程中的具體變化仍不清楚。 基于以上的研究背景，我們通過損傷動(dòng)脈外膜建立動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察病變中兩種內(nèi)源性大麻素anandamide(AEA)和2-arachidonoyl glycerol(2-AG)以及與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)的cannabinoid receptor2(CB2)受體的表達(dá)，探討內(nèi)源性大麻素在動(dòng)脈粥樣硬化的作用，同時(shí)觀察通心絡(luò)對AS斑塊中內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)表達(dá)的影響，進(jìn)一步了解藥物的作用機(jī)制。 第一

4、部分：內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在兔頸動(dòng)脈外膜損傷致動(dòng)脈粥樣硬化病變中的分布與表達(dá) 方法：24只新西蘭大白兔普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為普食組和高脂組，左側(cè)頸動(dòng)脈采用膠原酶消化＋機(jī)械分離法去除外膜及右側(cè)頸動(dòng)脈外膜假手術(shù)后分別于4周和8周處死，取雙側(cè)頸動(dòng)脈標(biāo)本行HE染色，免疫組化檢測血管內(nèi)CB2受體、CD68，ELISA方法檢測血管內(nèi)Interleukin-6(IL-6)和。Tumor necrosisfactor(TNF-α

5、)水平，LC-MS方法檢測血管內(nèi)內(nèi)源性大麻素AEA和2-AG。 結(jié)果：膠原酶消化＋機(jī)械分離可有效破壞血管外膜結(jié)構(gòu)的完整性；高脂喂養(yǎng)后血脂水平明顯增高；普食組雙側(cè)頸動(dòng)脈未見明顯內(nèi)膜增生，與普食組和高脂喂養(yǎng)假手術(shù)側(cè)血管相比，高脂組損傷側(cè)血管內(nèi)膜明顯增厚，于8周時(shí)可見有巨噬細(xì)胞浸潤的典型AS斑塊；在普食組血管中IL-6和TNF-α無明顯差別，而在高脂喂養(yǎng)4周和8周的損傷側(cè)血管內(nèi)IL-6和TNF-α含量均明顯增高，與普食組相比有明顯差異

6、；損傷側(cè)血管內(nèi)CB2受體主要表達(dá)于增生內(nèi)膜處，并且隨高脂飲食時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸增加，2-AG水平也隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間時(shí)間延長而逐漸增高，并且與血管內(nèi)炎性因子水平呈正相關(guān)，而AEA水平無明顯改變。 第二部分：內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在兔頸動(dòng)脈外膜損傷致動(dòng)脈粥樣硬化病變中的作用 方法：36只雄性新西蘭大白兔以左側(cè)頸總動(dòng)脈以膠原酶消化＋機(jī)械分離法去除外膜，右側(cè)頸動(dòng)脈假手術(shù)處理后隨機(jī)分為模型組、URB602凝膠組(于損傷頸動(dòng)脈外周涂以含M

7、AGL酶抑制劑URB602100umol/L的F-127凝膠)、通心絡(luò)組(通心絡(luò)0.4g/kg.d灌胃給藥)后，繼續(xù)給予高脂喂養(yǎng)，分別于4周和8周處死動(dòng)物取雙側(cè)頸動(dòng)脈標(biāo)本行HE染色，免疫組化檢測血管內(nèi)CB2受體、CD68染色，ELISA方法檢測血管內(nèi)IL-6和TNF-α水平，LC-MS方法檢測血管內(nèi)內(nèi)源性大麻素2-AG。 結(jié)果：8周模型組血脂水平均比4周模型組增高，URB602凝膠組與對應(yīng)時(shí)間的模型組無明顯差別，通心絡(luò)組與同一時(shí)

8、間模型組相比血脂明顯降低。 定量分析損傷側(cè)動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜面積比值表明4周URB602凝膠組與4周模型組相比，IMR明顯降低，而8周URB602凝膠組與8周模型組相比無明顯差異；通心絡(luò)組內(nèi)膜/中膜面積比值在4周與8周時(shí)均較模型組明顯下降。 隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長，各組8周血管中炎性因子水平均較4周時(shí)增高，URB602凝膠組與通心絡(luò)組同模型組相比，無論在4周還是8周時(shí)其炎癥因子水平均下降，通心絡(luò)組在8周時(shí)炎性因子水平最低。

9、 CB2受體主要表達(dá)于模型組增生內(nèi)膜中，并隨內(nèi)膜增生程度增加而表達(dá)增高，4周URB602凝膠組和通心絡(luò)組在減少內(nèi)膜增生的同時(shí)也減少CB2受體的表達(dá)。 8周模型組損傷側(cè)血管內(nèi)2-AG水平較4周時(shí)增高，URB602凝膠浸潤的4周血管中2-AG水平較模型組明顯增高，而在8周時(shí)URB602凝膠組與模型組2-AG相比增高不顯著，通心絡(luò)組在4周和8周時(shí)血管內(nèi)2-AG水平均較模型組明顯增高，以8周時(shí)2-AG水平最高。 結(jié)論：

10、 1、通過血管外膜損傷結(jié)合高脂飼養(yǎng)的方法可成功建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型； 2、血管病變局部炎癥因子IL-6、TNF-α水平以及內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)CB2受體和2-AG水平均隨粥樣硬化病變程度加重而顯著增加； 3、早期局部給予特異性MAGL活性抑制劑URB602進(jìn)一步提高組織中2-AG水平，可延緩動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)展以及炎性因子的表達(dá)； 4、通心絡(luò)在抑制頸動(dòng)脈外膜損傷所致的粥樣硬化病變的同時(shí)，顯著上調(diào)局部2-AG