外膜滋養(yǎng)血管新生在動(dòng)脈粥樣硬化早期病變中的作用及通絡(luò)干預(yù)研究.pdf

1、目的：本研究以中醫(yī)脈絡(luò)學(xué)說(shuō)及營(yíng)衛(wèi)理論為指導(dǎo)，采用單純高脂飲食建立兔AS早期病變高脂血癥模型，高脂飲食疊加右側(cè)頸動(dòng)脈硅膠管包裹術(shù)建立復(fù)合模型，通過(guò)觀察3天、1周、2周和4周時(shí)間節(jié)點(diǎn)各組頸動(dòng)脈病理形態(tài)、血脂、外膜滋養(yǎng)血管新生變化情況，探討外膜滋養(yǎng)血管新生在AS早期病變中的作用；根據(jù)模型制備成功時(shí)間，選擇術(shù)后4周為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，圍繞交感/副交感神經(jīng)和氧化應(yīng)激，深入探討AS早期外膜滋養(yǎng)血管新生相關(guān)機(jī)制及通絡(luò)藥物的干預(yù)作用。
　　方法：⑴180

2、只健康新西蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為正常組、高脂組及復(fù)合模型組，每組60只。正常組給予普通飼料，高脂組給予高脂飲食喂養(yǎng)建立AS早期高脂血癥模型，復(fù)合模型組給予高脂飲食疊加右側(cè)頸動(dòng)脈硅膠管包裹術(shù)，實(shí)驗(yàn)周期為4周。于術(shù)后3天、1周、2周和4周末行左心室灌注Microfil造影劑進(jìn)行Micro-CT檢查；DYE-TRAK彩色微球檢測(cè)術(shù)側(cè)頸動(dòng)脈管壁微血管血流量；生化法檢測(cè)血脂水平；HE染色觀察頸動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化；Western Blot檢測(cè)

3、頸動(dòng)脈外膜新生微血管CD34蛋白表達(dá)。⑵90只健康新西蘭兔隨機(jī)分為正常組、高脂組、復(fù)合模型組、復(fù)合模型+桂芍通絡(luò)高劑量組、復(fù)合模型+桂芍通絡(luò)低劑量組和復(fù)合模型+阿托伐他汀組，各組15只。造模同第一部分。各治療組實(shí)施高脂飲食復(fù)合右側(cè)頸動(dòng)脈硅膠管包裹，于造模當(dāng)天同時(shí)給予藥物干預(yù)，用0.5％羧甲基纖維素鈉混懸液將藥物配成所需濃度，給藥劑量為：桂芍通絡(luò)高劑量0.6g/kg/d、低劑量為0.3g/kg/d（相當(dāng)于臨床等效量），阿托伐他汀2.5mg

4、/kg/d，灌胃容積為3ml/kg，其他組別同第一部分，給藥4周后取材。生化法檢測(cè)血脂水平、黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）；TBA法檢測(cè)丙二醛（MDA）；化學(xué)比色法檢測(cè)總抗氧化能力（T-AOC）；HE染色檢測(cè)術(shù)側(cè)頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化；原位雜交檢測(cè)外膜 p22phox、gp91phox雜交信號(hào)；Micro-CT檢測(cè)術(shù)側(cè)頸動(dòng)脈外膜微血管密度；彩色微球檢測(cè)微血管灌注血流量變化；免疫組化檢測(cè)頸動(dòng)脈外膜 NGF、TH表達(dá)情況；Wester

5、n Blot檢測(cè)頸動(dòng)脈組織 NGF、TH、AchE、VEGF、VEGFR-2、ERK及 p-ERK蛋白表達(dá)水平。⑶90只健康新西蘭兔隨機(jī)分為正常組、高脂組、復(fù)合模型組、復(fù)合模型+PD98059（ERK抑制劑）組、復(fù)合模型+桂芍通絡(luò)高劑量組、復(fù)合模型+PD98059+桂芍通絡(luò)高劑量組，各組15只。提前將100ul PD98059溶解液置于25ml25%Pluronic@F-127凝膠液中，制成PD98059載藥凝膠（終濃度為200μmol

6、/L）。將0.5ml緩釋凝膠導(dǎo)管注入硅膠管，包裹于右側(cè)頸動(dòng)脈，抑制外膜局部ERK信號(hào)通路。于造模當(dāng)天同時(shí)給予桂芍通絡(luò)灌胃，實(shí)驗(yàn)周期為4周。HE染色觀察動(dòng)物術(shù)側(cè)頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化；彩色微球檢測(cè)微血管血流量變化；免疫組化檢測(cè)頸動(dòng)脈外膜NGF表達(dá)情況；Western Blot檢測(cè)頸動(dòng)脈外膜中NGF、TrkA、VEGF、ERK及p-ERK蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：①與正常組比較，高脂組血清TC、TG、LDL-C水平于高脂喂養(yǎng)2周到4周逐漸升高，

7、復(fù)合模型組TC、TG、LDL-C水平于1周到4周逐漸升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與高脂組相比，復(fù)合模型組血清TC、TG、LDL-C水平于1周時(shí)明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性（P<0.01），2周和4周時(shí)仍有升高趨勢(shì)。正常組頸動(dòng)脈內(nèi)膜光滑呈波浪狀，內(nèi)皮細(xì)胞完整連續(xù)，中膜以平滑肌細(xì)胞為主；高脂組和復(fù)合模型組3天、1周內(nèi)皮細(xì)胞完整，胞核扁平，中膜平滑肌走形清晰，2周內(nèi)膜輕微增厚，4周內(nèi)膜增生，中膜間隙增寬；而復(fù)合模型組4周內(nèi)膜

8、彌漫性增生，可見(jiàn)少量泡沫狀巨噬細(xì)胞，血管中膜間隙增寬，平滑肌和彈力纖維排列紊亂，損傷程度較高脂組更重。②正常血管滋養(yǎng)管沿頸動(dòng)脈規(guī)則的縱向排列，高脂組和復(fù)合模型組頸動(dòng)脈術(shù)側(cè)血管壁面積及微血管密度自術(shù)后1周開(kāi)始持續(xù)升高，與同期正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；與高脂組相比，復(fù)合模型組術(shù)側(cè)血管壁面積及微血管密度從實(shí)驗(yàn)1周后出現(xiàn)增加趨勢(shì)，2周和4周微血管密度明顯增加，外膜滋養(yǎng)血管呈致密的微血管叢分布，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

9、P<0.05，P<0.01）。③與同期正常組相比，高脂組術(shù)側(cè)管壁微血管血流量自術(shù)后2周開(kāi)始升高（P<0.05）；復(fù)合模型組在1周時(shí)已出現(xiàn)升高趨勢(shì)，2周后呈進(jìn)行性升高（P<0.01）；相較于高脂組，復(fù)合模型組管壁微血管血流量在1周和2周時(shí)即出現(xiàn)升高趨勢(shì)，4周時(shí)管壁微血管血流量明顯升高（P<0.05）。④正常頸動(dòng)脈外膜新生微血管CD34蛋白表達(dá)量較少；高脂組CD34蛋白表達(dá)量自1周至4周呈進(jìn)行性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05， P<0

10、.01）；而復(fù)合模型組CD34蛋白表達(dá)量從3天至4周呈進(jìn)行性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。⑤與正常組比較，高脂組和復(fù)合模型組血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與復(fù)合模型組比較，復(fù)合模型+桂芍通絡(luò)高劑量組、復(fù)合模型+桂芍通絡(luò)低劑量組和復(fù)合模型+阿托伐他汀組給藥后血清 TC、TG和 LDL-C水平明顯降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；各用藥組之間兩兩比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

11、（P>0.05）。⑥與正常組比較，高脂組和復(fù)合模型組血清MDA水平顯著升高，血清SOD及T-AOC水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與復(fù)合模型組比較，復(fù)合模型+桂芍通絡(luò)高劑量組、復(fù)合模型+桂芍通絡(luò)低劑量組和復(fù)合模型+阿托伐他汀組給藥后血清MDA水平下降（P<0.01），血清SOD和T-AOC水平明顯升高（P<0.01），各用藥組之間兩兩比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。⑦正常組頸動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞平整連續(xù)，與內(nèi)彈力板貼

12、合緊密，中膜以平滑肌細(xì)胞為主，走行清晰，外膜可見(jiàn)少量微血管；高脂組內(nèi)膜增生，中膜間隙增寬，外膜微血管數(shù)量增多；復(fù)合模型組內(nèi)膜彌漫性增生，可見(jiàn)少量泡沫狀巨噬細(xì)胞，血管中膜間隙增寬，平滑肌和彈力纖維排列紊亂，外膜微血管數(shù)量豐富；各用藥組頸動(dòng)脈病理?yè)p傷不同程度減輕：內(nèi)膜增生減輕，部分彈力纖維排列紊亂，中膜平滑肌走行較清晰，外膜微血管數(shù)量不同程度減少。⑧正常組主動(dòng)脈呈乳白色，內(nèi)膜光滑，未見(jiàn)油紅著色；高脂組主動(dòng)脈彈性較差，可見(jiàn)少量斑片狀紅色區(qū)域；

13、復(fù)合模型組主動(dòng)脈彈性差，胸主動(dòng)脈下段、腹主動(dòng)脈及分支部分可見(jiàn)斑片狀紅色，即脂質(zhì)條紋；各藥物干預(yù)組內(nèi)膜斑片狀紅色分布減少，內(nèi)膜較光滑。⑨正常組中g(shù)p91phox和p22phox基因雜交信號(hào)表達(dá)量極少，高脂組和復(fù)合模型組gp91phox和p22phox mRNA雜交顆粒廣泛分布，尤以內(nèi)膜和外膜部位顯著，各用藥組gp91phox和p22phox mRNA雜交信號(hào)在內(nèi)膜、外膜分布均有不同程度減弱。⑩與正常組比較，高脂組NGF、TH、AchE、V

14、EGF、VEGFR-2、p-ERK蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01）；與高脂組比較，復(fù)合模型組NGF、TH、AchE、VEGF、VEGFR-2、p-ERK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；與復(fù)合模型組比較，復(fù)合模型+桂芍通絡(luò)高劑量組、復(fù)合模型+低劑量組和復(fù)合模型+阿托伐他汀組 NGF、TH、AchE、VEGF、VEGFR-2、p-ERK蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01），各用藥組間兩兩比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

15、r>　　結(jié)論：①本研究以營(yíng)衛(wèi)理論與脈絡(luò)學(xué)說(shuō)為指導(dǎo)，探討動(dòng)脈管壁 VV新生在AS早期病變中的作用?；跔I(yíng)行脈中與血管內(nèi)皮相關(guān)，衛(wèi)行脈外與血管外膜相關(guān)，“孫絡(luò)”與“微血管”在解剖形態(tài)學(xué)上的同一性，以高脂飲食損傷內(nèi)皮建立高脂血癥兔模型，高脂飲食疊加右側(cè)頸動(dòng)脈硅膠管包裹術(shù)損傷外膜建立復(fù)合模型，探討動(dòng)脈管壁VV新生在AS早期病變中的作用及營(yíng)衛(wèi)通絡(luò)方藥干預(yù)作用，不僅有助于揭示營(yíng)衛(wèi)“由絡(luò)以通，交會(huì)生化”異常的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)于闡明AS“由外向內(nèi)”的

16、發(fā)病機(jī)制，尋找有效的干預(yù)藥物具有重要意義。②以高脂飲食建立高脂血癥兔模型，高脂飲食疊加右側(cè)頸動(dòng)脈硅膠管包裹術(shù)建立復(fù)合模型，與正常組比較，高脂組1周時(shí)微血管新生CD34蛋白表達(dá)量上調(diào)，微血管密度增加，2周時(shí)微血管灌注血流量升高；而復(fù)合模型組3天時(shí)CD34蛋白表達(dá)量較正常組上調(diào)，3天及1周時(shí)CD34蛋白表達(dá)量明顯高于高脂組，1周時(shí)微血管密度較高脂組出現(xiàn)升高趨勢(shì)，2周和4周時(shí)升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，微血管灌注血流量1周時(shí)出現(xiàn)較高脂組升高趨勢(shì)，4周較

17、高脂組明顯升高；頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)示高脂組及復(fù)合模型組2周時(shí)內(nèi)膜輕微增厚，4周時(shí)明顯增生，而復(fù)合模型組4周時(shí)內(nèi)膜增生程度較高脂組嚴(yán)重，以上結(jié)果表明高脂可引起外膜VV新生，且先于內(nèi)膜增生發(fā)生；復(fù)合模型可引起外膜VV新生程度加重，最終影響并加重AS病變程度。③與正常組比較，高脂組和復(fù)合模型組血管內(nèi)膜和外膜均可見(jiàn)明顯的gp91phox和p22phox mRNA雜交顆粒分布，血清MDA水平顯著升高，血清SOD及T-AOC水平下降；高脂組NGF,Trk

18、A，TH, AchE，VEGF，VEGFR-2， p-ERK1/2蛋白表達(dá)量上調(diào)，NE表達(dá)量增加，微血管密度及灌注血流量增加，而復(fù)合模型組除NE及微血管密度外，其余上述指標(biāo)均較高脂組升高，表明高脂組和復(fù)合模型組在引起外膜 VV新生的同時(shí)伴有氧化應(yīng)激損傷及交感神經(jīng)過(guò)度激活，復(fù)合模型組交感神經(jīng)激活程度較高脂組嚴(yán)重；NGF/TrkA/ERK1/2通路參與交感神經(jīng)過(guò)度激活促進(jìn)外膜 VV新生的病理過(guò)程。④以營(yíng)衛(wèi)理論與脈絡(luò)學(xué)說(shuō)指導(dǎo)研制的營(yíng)衛(wèi)通絡(luò)方—