血管外膜激活促使動(dòng)脈粥樣硬化病灶形成和進(jìn)展的研究.pdf

1、目前關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)病機(jī)制的研究中，占主導(dǎo)地位的是由R.Ross提出的又不斷加以修正的“損傷―反應(yīng)假說(shuō)”(theResponse-to-Injury Hypothesis)和“炎癥假說(shuō)”(the Inflammation Hypothesis)。兩假說(shuō)均認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)損傷、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VS

2、MC)增殖在AS發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，其中內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是AS病灶形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。在假說(shuō)的論述中一直未提及外膜在AS病灶形成和發(fā)展中的作用。傳統(tǒng)上認(rèn)為外膜只是血管外周一層松散的結(jié)締組織，僅僅對(duì)滋養(yǎng)血管和交感神經(jīng)末梢起支持作用。因?yàn)槠涿黠@的邊緣位置使血管外膜一直未成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。血管外膜特別是成纖維細(xì)胞在AS病灶形成和發(fā)展中的作用也不甚明了。 近年來(lái)，對(duì)于血管外膜究竟是心血管病變中無(wú)作用的旁觀者還是積極的參與者逐漸引起研究者

3、的重視。有研究資料提示血管外膜通過(guò)直接或間接作用對(duì)血管的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)起著重要的調(diào)控作用。成纖維細(xì)胞作為血管外膜最主要的細(xì)胞類(lèi)型，在血管病變過(guò)程中表現(xiàn)出組織學(xué)、生物化學(xué)和功能特性的變化，以調(diào)節(jié)血管對(duì)損傷和應(yīng)激的反應(yīng)能力。1962年Schwart和Mitchell對(duì)隨機(jī)選擇的111例35歲以上的男性和女性的440張組織切片進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管外膜炎癥程度與AS病變程度成正相關(guān)，并對(duì)血管外膜炎細(xì)胞的浸潤(rùn)程度進(jìn)行了分級(jí)。KimRayner則

4、在基因水平上進(jìn)一步闡明外膜炎癥對(duì)AS病灶形成的影響。他用原位雜交方法連續(xù)觀察高脂喂養(yǎng)0-12周載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein Eknockout，apoE(-/-))小鼠主動(dòng)脈切片，發(fā)現(xiàn)在AS病灶形成中，單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，JE/MCP-1)及其受體C-C趨化受體2(C-C chemokine receptor-2，CCR-2)的mRNA表達(dá)最早見(jiàn)于

5、外膜的間質(zhì)細(xì)胞，隨后才出現(xiàn)大量表達(dá)MCP-1的巨噬細(xì)胞。從而提示在內(nèi)膜損傷之前外膜中即有炎細(xì)胞的浸潤(rùn)。Mori等將MCP-1突變基因轉(zhuǎn)染至球囊損傷的兔頸動(dòng)脈局部骨骼肌后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染抑制了MCP-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，外膜巨噬細(xì)胞的聚集被顯著抑制，外膜纖維化程度減輕，從而使病理性血管重塑減弱。有報(bào)道血管外膜細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分在AS和再狹窄的過(guò)程中也發(fā)生改變。Durmowicz等觀察到血管外膜膠原和彈性蛋白產(chǎn)生和積聚在肺動(dòng)脈高壓進(jìn)程中顯著增加。Z

6、alcwski報(bào)告冠狀動(dòng)脈球囊成形術(shù)后先有外膜成纖維細(xì)胞的增殖，然后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MF)遷移到新生內(nèi)膜。而且在頸動(dòng)脈動(dòng)一靜脈移植中，外膜成纖維細(xì)胞的增生、向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、向新生內(nèi)膜的遷移都早于新生內(nèi)膜的增生。但是在這些相關(guān)研究報(bào)道中多數(shù)認(rèn)為血管外膜炎癥及其他外膜的反應(yīng)都是AS等心血管疾病的晚期病理變化。國(guó)內(nèi)外關(guān)于血管外膜參與AS病灶形成尤其是早期病灶形成的報(bào)道也非常少。我實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)

7、apoE(-/-)小鼠冠狀動(dòng)脈(coronaryartery，CA)主干和心肌內(nèi)CA小分支部分外膜區(qū)域有炎性細(xì)胞聚集，從而誘發(fā)該段AS病灶形成和延伸。 目的： 為進(jìn)一步探討血管外膜在AS病灶形成和進(jìn)展中的作用，本課題擬通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究aopE(-/-)小鼠血管外膜尤其是外膜成纖維細(xì)胞在AS發(fā)展的不同階段在表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移、膠原合成和各種細(xì)胞因子表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步更加系統(tǒng)地研究血管外膜特別是成纖維細(xì)胞激活與

8、AS病灶形成和發(fā)展的關(guān)系。另外，我們亦通過(guò)體外培養(yǎng)apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞，觀察其與對(duì)照組野生型C57BL/6小鼠在細(xì)胞表型、功能特性和基因表達(dá)譜的差異，從中選擇差異基因進(jìn)行分析，進(jìn)一步系統(tǒng)探討血管外膜成纖維細(xì)胞參與AS病灶形成的機(jī)制。因血管外膜的特殊位置，可以從中選取興趣基因以外膜為作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療，從而為AS的治療開(kāi)辟新的途徑，同時(shí)也為我們提出假說(shuō)-血管外膜成纖維細(xì)胞激活，促使早期動(dòng)脈粥樣硬化病灶形成及病灶的進(jìn)展

9、提供試驗(yàn)依據(jù)。 本第一部分：整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究血管外膜激活在As病灶形成及發(fā)展中的作用 方法： 選擇6周齡apoE-/-小鼠和野生型C57BL/6小鼠，分別給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料84.75％、飽和脂肪15％、膽固醇0.25％)0、2、4、和8周。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物前24小時(shí)經(jīng)腹腔注射5-溴-2-脫氧尿嘧啶(BrdU)，選取升主動(dòng)脈制備連續(xù)切片。部分切片進(jìn)行HE及Movat染色，以觀察組織形態(tài)學(xué)的變化并測(cè)量外膜厚度

10、的變化。部分切片行天狼猩紅染色，偏振光分析Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分布和含量的變化。用免疫組化方法觀察不同階段血管外膜和內(nèi)膜α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth Muscle-actin，α-SM-actin)、波形蛋白(vimentin)、結(jié)蛋白(desmin)、BrdU、MCP-1、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesionmolectlle-1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(Vascular cell adh

11、esionmolectlle-1，VCAM-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1(transforming growth factor beta l，TGF-β1)及p47phox等細(xì)胞因子表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)JE/MCP-1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果顯示： 1.apoE(-/-)小鼠血管外膜厚度隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加。其在高脂喂養(yǎng)4周后動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)泡沫細(xì)胞，高脂喂養(yǎng)8周后內(nèi)膜AS病灶進(jìn)一步發(fā)展。而C57BL

12、/6小鼠血管外膜厚度在高脂喂養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有顯著變化，而且也未觀察到內(nèi)膜損傷的任何跡象。 2.高脂喂養(yǎng)2周、4周后的apoE(-/-)小鼠外膜細(xì)胞檢測(cè)到少量α-SM-actin的陽(yáng)性表達(dá)，8W后幾乎無(wú)α-SM-actin的表達(dá)，desmin始終呈陰性，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)vimentin陽(yáng)性，顯示檢測(cè)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，并表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的特性。C57BL/6小鼠血管外膜始終未檢測(cè)到α-SM-actin的陽(yáng)性表達(dá)。 3

13、.apoE(-/-)小鼠隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，主動(dòng)脈外膜膠原含量增加，均高于對(duì)照組C57BL/6小鼠。高脂喂養(yǎng)前及2周后，主動(dòng)脈外膜膠原主要為Ⅲ型膠原，而高脂喂養(yǎng)4周，8周后，Ⅰ型膠原所占比例增加。而C57BL/6小鼠在高脂喂養(yǎng)前后主動(dòng)脈外膜膠原合成無(wú)顯著性變化。 結(jié)論： 1.在apoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病灶出現(xiàn)之前，動(dòng)脈外膜首先被激活，其主要表現(xiàn)是成纖維細(xì)胞激活，并促使病灶的形成和進(jìn)展。 2.在高脂血癥

14、等危險(xiǎn)因素作用下，在動(dòng)脈內(nèi)膜病灶形成之前，動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的特性、合成膠原纖維增多、增殖活性增強(qiáng)、合成和釋放活性細(xì)胞因子增多。 3.在高脂血癥等危險(xiǎn)因素作用下，在動(dòng)脈內(nèi)膜病灶形成之前，外膜滋養(yǎng)血管黏附分子表達(dá)增多，這也是外膜激活的表現(xiàn)之一。 4.氧化應(yīng)激既是血管外膜成纖維細(xì)胞激活的原因之一，又是成纖維細(xì)胞激活后通過(guò)旁分泌和自分泌方式，促進(jìn)病灶形成和發(fā)展的重要機(jī)理之一。 5.動(dòng)脈外膜炎癥是

15、動(dòng)脈粥樣硬化病灶形成和發(fā)展過(guò)程中的早期事件之一。 第二部分：體外培養(yǎng)血管外膜成纖維細(xì)胞研究其在AS病灶形成及發(fā)展中的作用 方法： 取6周齡apoE(-/-)小鼠和野生型C57BL/6小鼠，在高脂2周后用組織塊法體外培養(yǎng)血管外膜成纖維細(xì)胞，取3～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用免疫熒光法檢測(cè)vimentin、desmin和α-SM-actin的表達(dá)，結(jié)合透射電鏡觀察細(xì)胞表型變化。用羥脯氨酸測(cè)試盒測(cè)定膠原合成情況。分別用CCK-

16、8測(cè)試盒及BrdU摻入法測(cè)定細(xì)胞增殖活性的變化，流式細(xì)胞PI染色測(cè)定細(xì)胞周期。用插入式Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。NADPH氧化酶活性檢測(cè)試劑盒及超氧陰離子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞NADPH氧化酶活性及超氧陰離子的生成。應(yīng)用NADPH氧化酶的特異性抑制劑DPI作用于細(xì)胞然后再檢測(cè)細(xì)胞的增殖和遷移活性，觀察NADPH氧化酶對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和遷移活性的影響。采用基因芯片技術(shù)觀察細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異，然后用RT-PCR和Western

17、-blot在mRNA和蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證部分差異基因。將p47phox基因的Stealth siRNA，轉(zhuǎn)染apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞，觀察其對(duì)apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移活性的阻斷效應(yīng)。 結(jié)論： 1.apoE(-/-)小鼠與C57BL/6小鼠的成纖維細(xì)胞相比，部分轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。 2.apoE(-/-)小鼠與C57BL/6小鼠成纖維細(xì)