shRNA干擾沉默F(xiàn)ANCD2對人頭頸鱗癌SIHN-005A細(xì)胞體外生長及化療敏感性的影響.pdf

1、 目的：頭頸鱗癌(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)作為臨床上常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率近年來呈逐漸上升趨勢?，F(xiàn)有的局部手術(shù)切除及放化療綜合治療中,患者治療效果及5年生存率仍然不高。急需在HNSCC發(fā)生發(fā)展及治療敏感性理論研究領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展,以期為HNSCC患者的化療和基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)在前期短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)技

2、術(shù)靶向沉默F(xiàn)ANCD2的基礎(chǔ)上,觀察其對人HNSCC SIHN-005A細(xì)胞體外增殖、凋亡和細(xì)胞周期以及化療敏感性的影響,并對FANCD2 shRNA干擾影響化療敏感性的機(jī)制進(jìn)行初步研究,探討FANCD2用于HNSCC研究和治療的可行性,以期為增強(qiáng)人HNSCC化療敏感性以及提高化療療效探索新的方法,并對FA通路與頭頸腫瘤化療的聯(lián)系及可行性進(jìn)行展望。方法：(1)將前期試驗(yàn)獲得SIHN-005A細(xì)胞分為shRNA實(shí)驗(yàn)組(FANCD2 shR

3、NA)、無效序列對照組(FANCD2 shRNA-C)以及空白(未轉(zhuǎn)染)對照組(Control),復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)上述細(xì)胞,通過Western Blot檢測FANCD2蛋白沉默情況,并計(jì)算沉默效率；(2)通過細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(CCK-8法)檢測各組細(xì)胞在不同時(shí)間OD值,計(jì)算抑制率并繪制細(xì)胞生長抑制曲線；(3)Hoechst熒光染色法檢測各組細(xì)胞凋亡情況并觀察細(xì)胞凋亡形態(tài),比較FANCD2 shRNA沉默對SIHN-005A細(xì)胞凋亡的影響；

4、(4)Western Blot蛋白印跡法檢測細(xì)胞周期D1蛋白(Cyclin D1),比較FANCD2沉默對SIHN-005A細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；(5)CCK-8及Hoechst染 色 法 比 較 各 組 細(xì) 胞 在 加 用 DNA 交 聯(lián) 劑 順 鉑(Cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)干預(yù)后增殖、凋亡變化,Westerm Blot蛋白印跡法檢測FANCD2 shRNA沉默Cyclin D1蛋白表達(dá)變化,

5、比較FANCD2 shRNA沉默對SIHN-005A細(xì)胞化療敏感性的影響；(6)Westerm Blot蛋白印跡法檢測三組細(xì)胞未干預(yù)和加用CDDP后Bax,Bcl-2和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)蛋白表達(dá)變化情況,并討論shRNA干擾沉默F(xiàn)NACD2表達(dá)影響化療敏感性的可能機(jī)制。結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)組SIHN-005A細(xì)胞經(jīng)shRNA干擾有效沉默F(xiàn)ANCD2后蛋白表達(dá)灰度值(0.53±0.09)較之無效序列對照組(1.15±0.11)

6、(F=78.823,P<0.05)和空白對照組(1.34±0.07)(F=104.113, P<0.05)明顯下降,沉默效率達(dá)60.5%；(2)三組細(xì)胞培養(yǎng)并連續(xù)觀察72小時(shí),SIHN-005A FANCD2-shRNA細(xì)胞組增殖情況不及其余各組細(xì)胞,其抑制率隨時(shí)間的延長而增高,分別與空白對照組(F=48.647,P<0.05)及無效序列對照組(F=22.768,P<0.05)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(3)Hoechst染色結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組細(xì)

7、胞凋亡率( 13.19 ±1.38 )%高于無效序列對照組(2.22±2.01)%及空白對照組(1.18±0.05)%,SIHN-005A FANCD2-shRNA實(shí)驗(yàn)組與無效序列對照組(F=35.732, P<0.05)及空白對照組(F=42.387, P<0.05)相比凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(4)應(yīng)用Western Blot蛋白印跡法檢測細(xì)胞周期蛋白D1 ( Cyclin D1 )表達(dá)水平,計(jì)算灰度值發(fā)現(xiàn)FANCD2-shRNA實(shí)

8、驗(yàn)組中的表達(dá)水平( 0.73±0.11 )較無效序列對照組(0.96±0.14)和空白對照組(1.04±0.07)明顯下調(diào),實(shí)驗(yàn)組與無效序列對照組(F=8.317,P<0.05)和空白對照組(F=10.759,P<0.05)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(5)加入不同濃度CDDP后,CCK-8法檢測結(jié)果提示,各組SIHN-005A細(xì)胞OD值隨CDDP濃度的升高而降低(F=48.647,P<0.05),抑制率則隨CDDP濃度的升高而增高(F=29

9、.703, P<0.05),其中shRNA實(shí)驗(yàn)組的OD值較無效序列對照組(F=78.642,P<0.05)和空白對照組(F=82.521, P<0.05)明顯降低,實(shí)驗(yàn)組抑制率則較無效序列組(F=43.381,P<0.05)和空白對照組(F=67.928,P<0.05)明顯增高；16μg/ml CDDP作用于各組細(xì)胞后,其OD值(F=91.026, P<0.05)與抑制率(F=77.301, P<0.05)隨時(shí)間增加而增高,其中shRN

10、A實(shí)驗(yàn)組OD值明顯低于無效序列組(F=47.384, P<0.05)和空白對照組(F=57.275,P<0.05),實(shí)驗(yàn)組抑制率則明顯高于無效序列組(F=56.464, P<0.05)和空白對照組(F=69.022,P<0.05),shRNA實(shí)驗(yàn)組SIHN-005A細(xì)胞對CDDP的IC50值11.5±0.35μg/ml,明顯低于無效序列對照組18.4±1.11μg/ml ( F=46.324, P<0.05 )和未轉(zhuǎn)染對照組19.9±1

11、.42μg/ml(F=77.722, P<0.05)；16μg/ml CDDP作用48h后,Hoechst染色結(jié)果示shRNA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率(85.12 ±2.03)%高于無效序列對照組(17.87±1.63)%(F=383.812, P<0.05)及空白對照組(11.94±2.42)%(F =454.839, P<0.05),Western-Blot蛋白印跡法結(jié)果顯示shRNA實(shí)驗(yàn)組cyclin D1灰度值(0.55±0.09)較無

12、效序列對照組(0.89±0.18)(F=22.482, P<0.05)和空白對照組(0.97±0.24)(F=27.449, P<0.05)明顯降低,且加入CDDP后實(shí)驗(yàn)組cyclin D1灰度值(0.55±0.09)低于未加CDDP實(shí)驗(yàn)組灰度值(0.73±0.11)(F=19.867, P<0.05),即加用CDDP的shRNA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)較未加CDDP實(shí)驗(yàn)組更加明顯；(6)Western-Blot蛋白印跡法檢測各組細(xì)胞

13、在未加和加用CDDP后Bax,Bcl-2,HIF-1α等相關(guān)蛋白的表 達(dá)水平。結(jié)果顯示：加用CDDP后, Bax蛋白在shRNA實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)(2.78±0.17)較無效序列對照組(0.93±0.22)(F=193.272, P<0.05)及空白對照組(0.89±0.16)(F=211.736, P<0.05)明顯增強(qiáng),Bax表達(dá)在加入CDDP后的實(shí)驗(yàn)組(2.78±0.17)與未加CDDP的實(shí)驗(yàn)組(1.69±0.24)比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、意義(F=98.744, P<0.05)；Bcl-2蛋白加用CDDP后在shRNA實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)( 0.21±0.07 )較無效序列對照組( 0.54 ± 0.07 )( F=117.452, P<0.05)及空白對照組(0.79±0.21)(F=139.229, P<0.05)明顯下調(diào),Bcl-2的表達(dá)在加入CDDP后實(shí)驗(yàn)組(0.21±0.07)與未加CDDP實(shí)驗(yàn)組(0.63±0.06)的比較中差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=144.738,

15、 P<0.05)；檢測HIF-1α蛋白,加用CDDP后shRNA實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)( 0.60±0.29 )較無效序列對照組(1.25±0.56)(F=93.733, P<0.05)及空白對照組(1.39±0.22)(F=105.832, P<0.05)明顯下調(diào),同時(shí),HIF-1α表達(dá)在加入CDDP后實(shí)驗(yàn)組(0.60±0.29)與未加CDDP實(shí)驗(yàn)組(1.13±0.32)的比較中差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=187.454, P<0.05 )。結(jié)論

16、：( 1 )通過shRNA干擾技術(shù)能夠穩(wěn)定沉默人HNSCC SIHN-005A細(xì)胞FANCD2表達(dá)；(2)經(jīng)shRNA干擾靶向沉默F(xiàn)ANCD2蛋白表達(dá)能抑制人HNSCC SIHN-005A細(xì)胞增殖、加速和促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期于G1/S期,即引起SIHN-005A細(xì)胞的生物學(xué)功能改變；(3)在DNA交聯(lián)劑干預(yù)情況下,人HNSCC SIHN-005A FANCD2-shRNA細(xì)胞在細(xì)胞體外生長抑制及化療藥物增敏上均有顯著影響,表現(xiàn)在更

17、為明顯的抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和細(xì)胞周期阻滯上,即shRNA干擾沉默F(xiàn)NACD2表達(dá)能提高HNSCC SIHN-005A細(xì)胞對DNA交聯(lián)劑CDDP的敏感性。(4)shRNA沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)后可能通過下調(diào)cyclin D1和HIF-1α,提高Bax/Bcl-2比值等方式共同作用影響SIHN-005A細(xì)胞體外生長及化療敏感性變化。(5)FANCD2有望成為HNSCC研究和治療中新的靶點(diǎn)和研究目標(biāo),而shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的技術(shù)也可以