FANCD2 shRNA干擾對頭頸鱗癌頸淋巴結轉移細胞HSC-4放療敏感性的影響和機制研究.pdf

1、目的:頭頸部鱗狀細胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC)是臨床上常見的惡性腫瘤。HNSCC特別是鼻咽癌(NasopharyngealCarcinoma，NPC)98％屬于低分化鱗狀細胞癌，首選放射治療。然而，對于局部復發(fā)，遠處轉移和初次治療失敗的患者單純放療療效較差，特異性高、靶向性強的放療增敏技術及方法急需研發(fā)。課題組前期實驗已經證明FANCD2 shRNA干擾沉默FANCD2基

2、因表達后可通過影響HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4的體外生長增殖、凋亡、細胞周期及相關蛋白的表達提高HSC-4細胞對順鉑的敏感性。但關于FANCD2基因是否參與了HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4對放射治療敏感性的調控尚不得而知。本研究以FANCD2 shRNA干擾獲得的FANCD2穩(wěn)定沉默HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4為研究對象，研究HSC-4細胞放療后細胞體外增殖抑制效應、凋亡率、細胞周期分布、存活率及相關蛋白表達的變化

3、，探討沉默FANCD2對HSC-4細胞放療敏感性的影響及可能機制。
　　方法:以前期實驗獲得FANCD2沉默效應穩(wěn)定的HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4為研究對象，將實驗細胞分為三組，實驗組:FANCD2-shRNA（轉染含FANCD2有效干擾序列且FANCD2沉默效應穩(wěn)定的HSC-4細胞），空白對照組:HSC-4（未經轉染的HSC-4細胞），陰性對照組:FANCD2-shRNA-C（轉染FANCD2無效干擾序列的HSC-4細胞

4、）。三組細胞常規(guī)培養(yǎng)，陰性對照組及實驗組培養(yǎng)過程中以嘌呤霉素篩選。通過細胞增殖抑制試驗（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測三組HSC-4細胞在不同劑量及不同作用時間鈷60照射后生長增殖的情況，流式細胞術（AnnexinⅤ-FITC/PI染色法）測定三組HSC-4細胞鈷60照射后凋亡率和細胞周期改變，克隆形成法檢測三組HSC-4細胞放療后的存活率，以研究FANCD2 shRNA干擾對HSC-4細胞放療敏感性的影響;通

5、過Western Blot法檢測FANCD2 shRNA干擾以及放療后Bax、Bcl-2、p-38和p-p-38蛋白表達的變化，探討FANCD2與Bax、Bcl-2、p-38和P-p-38蛋白表達的關系，研究FNACD2 shRNA干擾影響HSC-4細胞放療敏感性的可能機制。
　　結果:(1) CCK-8檢測結果顯示隨著放療劑量加大三組細胞增殖抑制率均提高，且實驗組在各劑量照射后的增殖抑制效應均強于對照組(P＜0.05)，其中在放

6、療劑量增加至8Gy時實驗組吸光度值(OD)（0.256±0.027）明顯低于陰性對照組（0.362±0.008）和空白對照組（0.382±0.0213），增殖抑制作用最強，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=103.835，P＜0.05);照射劑量為5Gy作用24、48、72小時后，三組細胞增殖水平均隨時間延長而降低，照射后24、48、72小時各細胞組間OD值差異均有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計值分別為(F=6.307，P＜0.05)、(F=9.007，

7、P＜0.05)和(F=22.914，P＜0.05)，且實驗組增殖抑制效應較對照組更強;(2)流式細胞術檢測結果顯示8Gy放射治療后細胞常規(guī)培養(yǎng)48小時，實驗組細胞凋亡率（34.074±0.061）％明顯高于陰性對照組(5.926±0.038)％和空白對照組（14.241±0.047）％，差異有統(tǒng)計學意義(F=261.786，P＜0.05)，即說明shRNA干擾沉默FNACD2后HSC-4細胞由放療誘導的凋亡率增加;(3) shRNA干擾

8、沉默FANCD2后，三組細胞放射治療后48小時實驗組細胞周期變化為進入S期比例增加（F=160.778，P＜0.05），進入G0/G1期細胞減少(F=224.974，P＜0.05)，G2/M期比例無明顯差異(F=2.664，P＞0.05)，與陰性對照組及空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(4)克隆形成實驗結果顯示隨著放療劑量加大，各組細胞存活率均降低且各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，放療劑量增加至8Gy時shR

9、NA干擾組細胞存活率（0.007±0.021）較空白對照組（0.039±0.013）和陰性對照組（0.037±0.016）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.671，P＜0.05）。(5)Western Blot結果表明shRNA干擾沉默FANCD2表達后，實驗組細胞Bax(F=931.591，P＜0.05)和p-p38(F=685.425，P＜0.05)蛋白表達較對照組增強，p-38（F=1954.140，P＜0.05）和Bcl-2

10、(F=3219.791，P＜0.05)蛋白表達降低;各組細胞放射治療后，實驗組Bax(F=429.591，P＜0.05)和p-p38(F=214.974，P＜0.05)蛋白表達較對照組增強，p-38(F=1027.974，P＜0.05)和Bcl-2(F=285.974，P＜0.05)蛋白表達較對照組降低。
　　結論:(1) FANCD2 shRNA干擾能提高人HNSCC頸淋巴結轉移HSC-4細胞放療后的增殖抑制效應，促進細胞由放療

11、誘導的凋亡，導致細胞周期阻滯，降低細胞存活率，即shRNA干擾沉默FANCD2表達能提高人HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4對放射治療的敏感性;(2) FANCD2基因沉默可能通過調節(jié)細胞凋亡相關通路Bax/bcl-2蛋白的表達，促進HSC-4細胞放療誘導的凋亡，并通過激活p-38MAPK通路，導致p-p-38蛋白表達增強，共同參與HSC-4細胞放射治療后細胞增殖，凋亡、細胞周期分布的調控從而提高人HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4