FANCD2 shRNA干擾對頭頸鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞放療敏感性影響的動物實驗研究.pdf

1、目的：本課題組前期體外實驗已經(jīng)證實短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)能長期有效、穩(wěn)定的沉默頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squarecell carcinoma，HNSCC)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HSC-4細胞FANCD2基因的表達。shRNA干擾沉默HSC-4細胞FANCD2基因表達后，通過調(diào)控HSC-4細胞放射治療后的增殖、凋亡及細胞周期從而提高其對放射治療的敏感性，并初步闡明了其放療增敏機制可能與

2、激活p38絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，并通過調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白Bax、Bcl2的表達有關。本課題在此基礎上進一步通過體內(nèi)動物實驗探討FANCD2 shRNA干擾對HSC-4細胞裸鼠移植瘤的生長及放療敏感性的影響，并研究其可能存在的機制，為FANCD2成為HNSCC治療的新靶點提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　方法：以課題組前期實驗獲得的FANCD2基因沉默效應

3、穩(wěn)定的HSC-4細胞為研究對象，建立裸鼠皮下移植瘤模型。將15只雌性BALB/c-nu裸鼠編號后按隨機數(shù)字表法分為三組，每組5只。實驗組:FANCD2-shRNA（接種轉(zhuǎn)染FANCD2有效干擾序列且沉默效應穩(wěn)定的HSC-4細胞），陰性對照組:FANCD2-shRNA-C（接種轉(zhuǎn)染FANCD2無效干擾序列的HSC-4細胞），空白對照組:HSC-4（接種未經(jīng)任何處理的野生型HSC-4細胞）。通過動物體內(nèi)實驗，觀察三組細胞成瘤率、成瘤時間及瘤

4、體生長情況;于HSC-4細胞接種28天后行裸鼠皮下移植瘤瘤體局部常規(guī)分割放療，2Gy/次，1次/天，連續(xù)5天，觀察放療后三組瘤體體積變化情況，繪制瘤體體積生長曲線;于放療結(jié)束后的第10天用頸椎脫臼法處死裸鼠，迅速完整剝離瘤體，稱取瘤體重量，計算腫瘤抑瘤率;瘤體常規(guī)病理HE染色，觀察瘤體病理學特點;DNA斷裂的原位末端標記法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End

5、Labeling,TUNEL)檢測瘤體內(nèi)腫瘤細胞凋亡情況;免疫組化Envision法(Immunohistochemistry, IHC)及免疫印跡(Western Blot，WB)檢測瘤體放療后Bax、Bcl2、p38和p-p38蛋白表達的變化，探討FANCD2 shRNA干擾對HSC-4細胞放療敏感性的影響與Bax、Bcl2、p38和p-p38蛋白表達的關系及其可能存在的機制。
　　結(jié)果：⑴HSC-4細胞裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯

6、示:三組的15只裸鼠均形成肉眼可見的瘤塊，成瘤率100％;與對照組相比，實驗組裸鼠皮下移植瘤成瘤時間延長、生長減緩、瘤體體積及重量明顯減小。實驗組HSC-4細胞成瘤時間為9～10天，中位時間10天;陰性對照組及空白對照組成瘤時間為5～7天，中位時間6天。放療前實驗組瘤體體積為57.88±5.12mm3，顯著低于陰性對照組89.95±7.44mm3與空白對照組98.83±6.31mm3(F=56.474，P＜0.05);放療后實驗組瘤體體

7、積為11.11±5.25mm3，顯著低于陰性對照組57.96±11.36mm3與空白對照組67.42±4.40mm3(F=77.466，P＜0.05)，且實驗組放療后瘤體體積縮小了46.77±2.76mm3，顯著多于陰性對照組31.41±3.52mm3與空白對照組31.09±7.69mm3(F=15.206，P＜0.05);放療后實驗組瘤體重量0.034±0.015g顯著低于陰性對照組0.092±0.023g與空白對照組0.100±0.

8、045g(F=6.950，P＜0.05);實驗組瘤體重量抑瘤率為66.00±15.17％，體積抑瘤率為83.52±7.78％;瘤體HE染色見腫瘤細胞成巢狀分布，可見環(huán)狀紅染的角化珠和細胞間橋，細胞異形性明顯，核分裂象多見，符合鱗癌的病理學特點。⑵TUNEL結(jié)果顯示:放療后三組瘤體均有不同程度的凋亡細胞，但實驗組凋亡細胞數(shù)顯著高于陰性對照組與空白對照組;實驗組的凋亡指數(shù)AI(apoptotic index，AI)為56.02±6.51％，

9、顯著高于陰性對照組30.80±4.47％與空白對照組26.22±5.82％(F=80.216，P＜0.05)。⑶IHC結(jié)果顯示:放療后，實驗組較對照組Bax、 p-p38蛋白表達顯著增加，Bcl2、 p38蛋白表達顯著降低;實驗組Bax蛋白的平均光密度（mean optical density, MOD）值為0.190±0.022，顯著高于陰性對照組0.168±0.015與空白對照組0.163±0.012(F=6.594，P＜0.05)

10、;實驗組p-p38蛋白的MOD值為0.224±0.015，顯著高于陰性對照組0.173±0.016與空白對照組0.165±0.015(F=20.778，P＜0.05);實驗組Bcl2蛋白的MOD值為0.147±0.013，顯著低于陰性對照組0.176±0.012與空白對照組0.168±0.008（F=16.137, P＜0.05）;實驗組p38蛋白的MOD值為0.161±0.016，顯著低于陰性對照組0.191±0.010與空白對照組0

11、.200±0.029(F=15.330，P＜0.05)。⑷WB結(jié)果顯示:放療后，實驗組較對照組Bax、p-p38蛋白表達顯著增加，Bcl2、p38蛋白表達顯著降低;實驗組Bax蛋白的灰度值為0.219±0.008，顯著高于陰性對照組0.089±0.005與空白對照組0.091±0.005(F=6.594，P＜0.05);實驗組p-p38蛋白的灰度值為0.129±0.005，顯著高于陰性對照組0.020±0.004與空白對照組0.024±

12、0.004(F=652.917，P＜0.05);實驗組Bcl2蛋白的灰度值為0.053±0.005，顯著低于陰性對照組0.097±0.013與空白對照組0.105±0.008(F=25.200,P＜0.05);實驗組p38蛋白的灰度值為0.021±0.002，顯著低于陰性對照組0.215±0.007與空白對照組0.233±0.006(F=1314.201，P＜0.05)。
　　結(jié)論：①FANCD2 shRNA干擾延長了HSC-4細

13、胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤時間，并抑制HSC-4細胞在裸鼠體內(nèi)的生長;②FANCD2 shRNA干擾降低了放療后裸鼠HSC-4細胞移植瘤瘤體的體積和重量，增加了放療后裸鼠HSC-4細胞的抑瘤率，促進了放療引起的HSC-4細胞凋亡，即在活體內(nèi)FANCD2 shRNA干擾提高了HSC-4細胞對放療的敏感性;③FANCD2 shRNA干擾對裸鼠HSC-4細胞移植瘤的放療增敏機制與激活p38 MAPK信號通路，并通過調(diào)控凋亡相關蛋白Bax、Bcl2的表