逆轉(zhuǎn)糖酵解-基于糖代謝的肝癌治療新策略研究.pdf

1、目的:饑餓狀態(tài)下機(jī)體的肝細(xì)胞通過糖異生來保證重要器官的葡萄糖供給。惡性轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞是否還具有糖異生的能力目前尚不清楚。有氧糖酵解是惡性腫瘤的重要標(biāo)志,除了三步不可逆反應(yīng)外,糖異生的其余七步反應(yīng)均是糖酵解的逆反應(yīng),因此可以說糖異生拮抗糖酵解。本研究將探討人和小鼠肝癌組織中糖異生的變化及相應(yīng)的肝癌治療策略。
　　方法:(1)Real-time PCR和免疫組化分析10例肝癌病人肝癌組織中糖異生的限速酶PEPCK、G6Pase和調(diào)控糖皮

2、質(zhì)激素的兩個關(guān)鍵酶11β-HSD1、11β-HSD2的表達(dá),進(jìn)一步免疫組化分析58例肝癌病人的肝癌組織和癌旁組織中11β-HSD1和11β-HSD2的表達(dá),并統(tǒng)計分析11β-HSD1/11β-HSD2的比值與肝癌病人的生存時間和腫瘤復(fù)發(fā)率的關(guān)系。
　　(2)RT-PCR、Western blot和免疫組化分析小鼠肝癌組織中PEPCK、G6Pas、11β-HSD1和11β-HSD2的表達(dá),進(jìn)一步建立高表達(dá)11β-HSD1或下調(diào)11β

3、-HSD2的肝癌細(xì)胞,并將高表達(dá)11β-HSD1或下調(diào)11β-HSD2的肝癌細(xì)胞接種小鼠進(jìn)行腫瘤生長實驗,驗證11β-HSD1和11β-HSD2對肝癌生長的影響,并采用RT-PCR檢測相應(yīng)高表達(dá)11β-HSD1或下調(diào)11β-HSD2的肝癌組織中PEPCK和G6Pase的表達(dá),以探討糖異生對肝癌生長的影響。
　　(3)體外條件下,分別用0μM、0.1μM、1μM、10μM地塞米松處理H22細(xì)胞一周后,RT-PCR和Western b

4、lot檢測PEPCK和G6Pase的表達(dá)并檢測胞內(nèi)葡萄糖的變化。體內(nèi)條件下,皮下接種H22細(xì)胞至BALB/c右背側(cè),4天后隨機(jī)分為四組(6只/組),分別腹腔注射0μg/g、1.25μg/g、2.5μg/g和5μg/g地塞米松,觀察并記錄腫瘤生長情況,16天后處死小鼠分離肝癌組織,RT-PCR和Western blot檢測PEPCK和G6Pase的表達(dá)并檢測組織內(nèi)葡萄糖的變化。為排除不同接種部位對地塞米松治療效果的影響,建立小鼠原位肝癌模

5、型,隨機(jī)分為四組(6只/組)分別腹腔注射0μg/g、1.25μg/g、2.5μg/g和5μg/g地塞米松,16天后處死小鼠,觀察腫瘤大小。為探討對地塞米松對非肝臟來源的腫瘤的影響,皮下接種B16細(xì)胞至C57BL/6右背側(cè),4天后隨機(jī)分為四組(6只/組),分別腹腔注射0μg/g、1.25μg/g、2.5μg/g和5μg/g地塞米松,觀察并記錄腫瘤生長情況;為探討地塞米松治療腫瘤的機(jī)制,采用PEPCK抑制劑3-MPA和地塞米松聯(lián)合治療H22

6、皮下瘤小鼠,觀察并測量腫瘤生長情況;最后利用非活性形式的糖皮質(zhì)激素潑尼松體外處理H22細(xì)胞,體內(nèi)治療H22皮下瘤小鼠,RT-PCR分析PEPCK和G6Pase的表達(dá)并記錄腫瘤生長情況。
　　(4)皮下接種H22細(xì)胞至BALB/c右背側(cè),4天后隨機(jī)分為四組(6只/組),分別腹腔注射0μg/g、1.25μg/g、2.5μg/g和5μg/g地塞米松,16天后處死小鼠分離肝癌組織,RT-PCR檢測一系列代謝相關(guān)基因(HK2,PFK1,PK

7、M2,LDHA,PDHA1,CS,SDHA,ACL,ACC,HMGCR,G6PD,GPD1)的表達(dá),Real-time PCR和Western blot進(jìn)一步檢測中LDH和GPD1的表達(dá)并檢測腫瘤組織內(nèi)乳酸的水平。
　　結(jié)果:(1)肝癌病人肝癌組織中糖異生限速酶PEPCK、G6Pase表達(dá)顯著下調(diào),調(diào)控糖皮質(zhì)激素的關(guān)鍵酶11β-HSD1表達(dá)下調(diào),而11β-HSD2表達(dá)上調(diào),且肝癌病人中11β-HSD1和11β-HSD2在癌旁組織和

8、肝癌組織中表達(dá)呈逆關(guān)聯(lián),即癌旁組織中11β-HSD1表達(dá)高、11β-HSD2表達(dá)低,而肝癌組織恰與此相反11β-HSD1表達(dá)低、11β-HSD2表達(dá)高,進(jìn)一步統(tǒng)計結(jié)果顯示11β-HSD1/11β-HSD2比值與肝癌病人總體生存時間與復(fù)發(fā)率相關(guān)。
　　(2)小鼠肝癌組織中PEPCK和G6Pase表達(dá)顯著下調(diào),糖異生喪失,11β-HSD1表達(dá)下調(diào),而11β-HSD2表達(dá)上調(diào),恢復(fù)小鼠肝癌細(xì)胞H22中11β-HSD1和11β-HSD2的

9、表達(dá)后,小鼠腫瘤生長變慢且腫瘤組織內(nèi)PEPCK和G6Pase表達(dá)上調(diào)。
　　(3)體外條件下,地塞米松可上調(diào)H22細(xì)胞中PEPCK和G6Pase的表達(dá)并上調(diào)胞內(nèi)葡萄糖含量,體內(nèi)條件下,地塞米松可抑制皮下瘤肝癌和原位肝癌的生長并上調(diào)肝癌組織內(nèi)的PEPCK和G6Pase的表達(dá)和相應(yīng)的葡萄糖含量,但是對小鼠黑色素瘤無影響,揭示地塞米松對肝癌治療的特異性,同時利用PEPCK的抑制劑3-MPA可阻斷地塞米松對肝癌的抑制作用,揭示地塞米松可能

10、是通過糖異生途徑抑制肝癌,且非活性形式的糖皮質(zhì)激素潑尼松體外對H22的PEPCK和G6Pase表達(dá)無影響,體內(nèi)對小鼠皮下瘤無抑制作用。
　　(4)地塞米松治療后小鼠肝癌組織中LDH和GPD1表達(dá)下調(diào)且相應(yīng)組織內(nèi)乳酸水平降低。
　　結(jié)論:人和小鼠肝癌細(xì)胞中調(diào)控糖皮質(zhì)激素的關(guān)鍵酶11β-HSD1和11β-HSD2表達(dá)逆轉(zhuǎn),導(dǎo)致內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的失活和糖異生的喪失。11β-HSD1/11β-HSD2的比值與肝癌病人的生存時間和腫瘤