油茶種仁糖酵解途徑解析及醛縮酶基因家族功能研究.pdf

1、油茶是我國(guó)特色油料樹(shù)種，主要栽培分布于南方丘陵酸性紅壤地區(qū)。茶油因其品質(zhì)優(yōu)良而受到國(guó)家的高度重視。但是單位面積產(chǎn)量低一直是制約油茶產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的主要因素。油茶常規(guī)育種周期長(zhǎng)，常規(guī)雜交育種可能伴有遺傳累贅。采用分子設(shè)計(jì)育種新方法改良油茶，可實(shí)現(xiàn)單一性狀或多個(gè)性狀的定向改良，大大縮短育種周期，而且不會(huì)帶有遺傳累贅。糖酵解代謝途徑是油茶種仁油脂合成的上游代謝途徑，其代謝速率直接影響油茶種子油脂合成的效率。果糖1，6-二磷酸醛縮酶不僅是糖酵解代

2、謝途徑中的樞紐調(diào)控酶，也是油茶種子油脂合成的樞紐調(diào)控酶，還可以調(diào)控油茶的生殖生長(zhǎng)。本文以國(guó)審油茶品種‘華碩’種仁為材料，通過(guò)構(gòu)建數(shù)字化轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，系統(tǒng)解析了油茶種仁糖酵解途徑及其與油茶油脂合成和生殖生長(zhǎng)的關(guān)系;克隆了4個(gè)油茶果糖1，6-二磷酸醛縮酶(CoFBA)家族基因;開(kāi)展了該酶的亞細(xì)胞定位研究;分析了該基因表達(dá)與油茶種仁含油率等的關(guān)聯(lián)性;構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體和RNA干擾載體，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥和油菜，獲得了T0代和T1代轉(zhuǎn)基因植

3、株。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為油茶分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了一定的科學(xué)和技術(shù)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.油茶種仁糖酵解途徑的分子生物學(xué)解析。以果實(shí)膨大期（6月）和油脂合成高峰期（10月）的油茶種仁為材料，建立了油茶種仁2個(gè)時(shí)期的合并轉(zhuǎn)錄組和2個(gè)不同時(shí)期數(shù)字化表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)分析顯示，油茶種仁糖酵解途徑主要包含306條Unigene，分別歸屬于23類(lèi)酶基因，即磷酸葡萄糖變位酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡糖磷酸異構(gòu)酶、N-乙酰氨基葡

4、萄糖-6-磷酸-異構(gòu)酶、二磷酸酯酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、二磷酸甘油酸變位酶、醛鐵氧還蛋白還原酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶（硫辛酰胺）、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、二氫硫辛酸脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、L-乳酸脫氫酶、醛脫氫酶、乙醇脫氫酶、甲醇脫氫酶（細(xì)胞色素c）和乙醇脫氫酶（細(xì)胞色素c）。這些酶基因大部分為基因家族，其所包含的不同Unigene在油茶種仁發(fā)

5、育的不同時(shí)期存在差異表達(dá)。油茶種仁表達(dá)譜糖酵解途徑Pathway顯著性富集分析結(jié)果顯示:該代謝途徑調(diào)控基因表達(dá)整體上調(diào)，由初期始樣本表達(dá)量26（6月）上調(diào)至高峰期樣本表達(dá)量336（10月）。根據(jù)油茶種仁轉(zhuǎn)錄組糖酵解/異生代謝途徑Unigene數(shù)據(jù)分析和不同時(shí)期油茶種仁糖酵解代謝功能基因表達(dá)差異分析，總結(jié)繪制了油茶種仁糖酵解代謝調(diào)控途徑。在分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中有11條CoFBAUnigene序列，其中有2條在油脂合成高峰期原始表

6、達(dá)量是果實(shí)膨大期原始表達(dá)量的3-4倍，明顯高于糖酵解途徑中其他調(diào)控酶基因的表達(dá)量和變化幅度;油茶FBA從甘油代謝途徑和脂肪代謝途徑直接影響油茶種仁的油脂合成，是影響油茶油脂合成的關(guān)鍵酶之一。
　　 2.油茶FBA家族基因克隆及生物信息學(xué)分析。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，分別設(shè)計(jì)特異引物，采用RACE技術(shù)，逐一克隆了4個(gè)油茶FBA基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并在NCBI中注冊(cè)，GenBank登錄號(hào)分別為JN017093.1、JX914588、

7、JX914589和JX914590。將該4個(gè)基因分別命名為CoFBA1、CoFBA2、CoFBA3和CoFBA4。生物信息學(xué)方法分析表明，這4個(gè)CoFBA基因均無(wú)信號(hào)肽，為親水性蛋白，含有典型的1，6-二磷酸果糖醛縮酶活性結(jié)構(gòu)，其中CoFBA1、CoFBA3和CoFBA4存在“VMFEGILLKPS”特異結(jié)構(gòu)域，CoFBA2存在“VLLEGTLLKPN”特異結(jié)構(gòu)域;CoFBA蛋白家族分為A、B兩個(gè)亞族，CoFBA2歸為B亞族，而CoFB

8、A1、CoFBA3和CoFBA4歸為A亞族，這意味著分化的先后多少與其活性位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)以及功能的差異是密切相關(guān)的?？臻g結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)CoFBA1和CoFBA4與巴貝斯分枝桿菌1，6-二磷酸醛縮酶3kx6A結(jié)構(gòu)相似，而CoFBA2和CoFBA3分別與兔肌肉醛縮酶31geB和惡性瘧原蟲(chóng)二磷酸醛縮酶2pc4C結(jié)構(gòu)相似。
　　 3.油茶FBA蛋白亞細(xì)胞定位研究。采用基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞法進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)CoFBA并不單單定位于細(xì)胞質(zhì)。

9、結(jié)果顯示，CoFBA1可能定位于細(xì)胞核，CoFBA2可能定位于細(xì)胞質(zhì)，CoFBA3可能定位于周質(zhì)，CoFBA4可能定位于細(xì)胞外，這些結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的外膜、細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)和外膜稍有差別。但無(wú)論是預(yù)測(cè)信息還是實(shí)驗(yàn)結(jié)果，都體現(xiàn)出CoFBA表達(dá)部位的多樣性，而預(yù)測(cè)顯示這4個(gè)醛縮酶均為非分泌性蛋白，如何轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，可能與其含有的肉豆蔻?；疤腔稽c(diǎn)有關(guān)。
　　 4.油茶FBA基因的表達(dá)對(duì)油茶種仁含油率的影響。油茶果實(shí)和種仁的表型特

10、征能體現(xiàn)種仁含油率的差異，果實(shí)膨大期之前種皮乳白色，種仁白色，此時(shí)含油率僅10％左右，果實(shí)近成熟期種皮黑褐色，種仁油黃色，此時(shí)含油率升至50％左右。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期油茶種仁中CoFBA1、CoFBA2、CoFBA3和CoFBA4相對(duì)表達(dá)量，并對(duì)照比較了脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因CoACP、CoSAD和CoFAD2相對(duì)表達(dá)量，結(jié)合不同發(fā)育時(shí)期油茶種仁含油率的變化，采用灰色關(guān)聯(lián)分析法，揭示其綜合關(guān)聯(lián)度分別為CoFBA1

11、(0.762817)、CoFBA2(0.649344)、CoFBA3(0.672756)、CoFBA4(0.646704)，這與脂肪酸代謝關(guān)鍵酶基因的綜合關(guān)聯(lián)度CoACP(0.673442)、CoSAD(0.699459)、CoFAD2(0.653404)相比差異不大，說(shuō)明油茶種仁油脂合成不僅與脂肪酸代謝途徑中各關(guān)鍵酶基因相關(guān)，而且糖酵解途徑中關(guān)鍵酶基因也起到等同甚至更重要的影響。CoFBA基因家族表達(dá)調(diào)控對(duì)油茶種仁含油率具有一定的影響

12、，通過(guò)調(diào)控CoFBA的表達(dá)在一定程度上有可能提高油茶的種仁含油率。
　　 5.超量表達(dá)載體和RNA干擾載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究。構(gòu)建了CoFBA1、CoFBA2、CoFBA3和CoFBA4的過(guò)表達(dá)載體，CoFBA家族共抑制RNA干擾Gateway載體和對(duì)照用AtFBA家族RNA干擾Gateway載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化哥倫比亞野生型擬南芥，篩選獲得了T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥;采用Gateway技術(shù)構(gòu)建CoFBA1過(guò)表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘