靈芝基因沉默體系的建立及NADPH氧化酶基因家族功能分析.pdf

1、靈芝（Ganodermalucidum）是著名的大型藥用真菌，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，在我國和東南亞國家有著悠久的應用歷史。靈芝三萜類化合物是靈芝的主要藥用成分之一，具有抗氧化、抗病毒、降血壓和抗腫瘤等活性。靈芝三萜含量的多少是目前衡量靈芝質量高低的重要指標。最近靈芝基因組測序工作已經(jīng)完成，為從分子遺傳學水平研究靈芝三萜生物合成等靈芝基礎生物學研究提供數(shù)據(jù)支持，有利于推動靈芝成為一種新型模式藥用真菌，增加其科研和商業(yè)價值。但是，靈

2、芝中缺乏簡便有效的反向遺傳學體系，限制了人們對靈芝功能基因組學研究的進展，影響了其藥用價值的開發(fā)。因此，本研究將從靈芝基因沉默體系的建立，并應用該體系對NADPH氧化酶基因家族功能研究來探討靈芝三萜調控機制。主要分為以下幾個方面:
　?。ㄒ唬╈`芝沉默體系建立:RNA干擾技術(RNAi)作為一種常見的反向遺傳學基因操作技術被廣泛應用在動物、植物和微生物功能基因組學研究領域。在本課題研究中，首先通過基于電擊轉化不完全酶解靈芝原生質體的

3、方法建立了靈芝中簡便快捷的轉基因技術，成功的將外源綠色熒光蛋白轉入靈芝中。通過抗生素抗性傳代、標記基因PCR檢測、綠色熒光檢測等手段確定了該方法能夠進行外源基因表達，為靈芝RNAi技術的建立提供轉基因操作平臺。進一步在靈芝中通過BLAST對比分析發(fā)現(xiàn)具有Dicer同源蛋白，暗示靈芝可能具有RNAi的機制，利用靈芝內源乳清酸核苷-5'-單磷酸脫羧酶基因（ura3作為反向篩選標記，構建四種沉默載體（頸環(huán)結構沉默載體，正向沉默載體，反向沉默載

4、體以及正反雙向啟動子沉默載體）并基于此轉基因方法實現(xiàn)了對靈芝內源基因的沉默。通過系統(tǒng)的比對以上四種沉默方法，發(fā)現(xiàn)四種沉默方法都不同程度的下調了ura3基因的表達，其中雙向啟動子沉默不僅載體構建方便并且能夠獲得最高的沉默效率（達到81.9％）。利用這種雙向啟動子沉默載體以及ura3的反向篩選特性，進而建立了靈芝的共沉默體系，發(fā)現(xiàn)共沉默基因（ura3和laccase1）轉錄水平的下調是有一定相關性的，這提高了基因沉默的篩選效率。該反向遺傳體

5、系的建立有助于深入研究靈芝中單基因或多基因的功能，為本課題接下來對NADPH氧化酶基因家族的功能研究提供技術支持。
　?。ǘADPH氧化酶功能的分析:NADPH氧化酶(Nox)是一類與活性氧(ROS)合成有關的酶，最近有研究表明其在植物與動物中有多種重要的生物學作用，但是，在絲狀真菌特別是大型擔子菌中Nox的具體功能還沒有完全被了解。在本課題研究中，根據(jù)靈芝基因組測序序列，鑒定出NADPH氧化酶基因的兩種Nox亞型（NoxA

6、和NoxB）和一種Nox調控基因NoxR。采用正反雙啟動子RNA沉默的方法研究Nox家族功能。通過沉默NoxA，NoxB和NoxR基因的表達，并對其表型研究，發(fā)現(xiàn)這個基因家族在ROS的合成，調控靈芝三萜的生物合成、子實體發(fā)育以及抗氧化脅迫等方面有重要作用。Nox沉默菌株表現(xiàn)出ROS積累降低，靈芝三萜生物合成下調，子實體發(fā)育受阻以及對H2O2耐受性降低等表型。
　　（三）Nox對鈣信號的調控機制研究:動植物中，ROS被報道能夠與鈣信

7、號通路進行互作，激活鈣通道，增加鈣離子向胞內的流入進而影響鈣信號傳遞。其中，鈣離子作為生物體內重要的第二信使參與多種生物學功能，但是此類信號調控機制在真菌中鮮有報道。為了驗證靈芝中Nox產(chǎn)生的ROS能否對鈣信號產(chǎn)生影響，本課題檢測了Nox沉默菌株中胞內鈣離子含量，發(fā)現(xiàn)Nox沉默轉化子中胞內鈣離子水平顯著降低。對其調控機理研究發(fā)現(xiàn)，靈芝中ROS影響胞內鈣離子水平是通過激活鈣通道增加鈣流入實現(xiàn)的，同時結合轉錄水平分析了靈芝中37個鈣信號基因

8、響應ROS的表達情況，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)鈣離子信號基因在ROS刺激早期被激活表達，而在刺激后期多數(shù)被下調表達。通過對Nox沉默轉化子中鈣信號基因的轉錄進一步分析，發(fā)現(xiàn)鈣信號基因轉錄能夠受到Nox沉默影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)Nox調控靈芝三萜生物合成及菌絲分叉是通過鈣信號實現(xiàn)的，阻斷鈣信號將導致ROS的調控效果消失。
　　綜上所述，本研究突出了在靈芝中NADPH氧化酶在靈芝ROS和鈣信號交互中的作用，與動物植物中一樣，在細胞的生理過程中Nox產(chǎn)