PGAM1在mTOR誘導腫瘤有氧糖酵解中的作用及機制研究.pdf

1、糖代謝異常被認為是腫瘤的重要特征之一。上世紀20年代德國科學家Otto Warburg首先發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞無論氧氣充足與否，均選擇進行產(chǎn)能效率較低的糖酵解途徑，葡萄糖消耗、糖酵解速率以及乳酸生成均較正常細胞明顯增加，因此稱為“Warburg效應”或“有氧糖酵解”。然而，腫瘤細胞為什么會發(fā)生糖酵解，其在腫瘤發(fā)生中的作用及機制等，仍有待于進一步研究。
　　哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，

2、mTOR)通路活化是腫瘤中最常見的信號通路異常。該通路中的抑癌基因如結節(jié)性硬化復合體1/2（Tuberoussclerosis complex1/2，TSC1/2）和人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的失活均可以導致mTOR通路過度活化，從而促進腫瘤發(fā)生。我們的前期研究表明，mTOR通路活化能夠促進W

3、arburg效應的發(fā)生。
　　磷酸甘油酸變位酶1（Phosphoglyceratemutase1，PGAM1）是糖酵解途徑中重要的催化酶之一，在多種腫瘤組織中有高表達，且與糖代謝調節(jié)有關。然而，其在腫瘤中的作用及調節(jié)機制并不是很清楚。為探討PGAM1在腫瘤細胞中表達上調的可能機制，以及PGAM1在mTOR通路活化導致的有氧糖酵解和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題研究分為以下三個部分：
　　第一部分，利用Tsc2和Pten敲除導致

4、mTOR通路活化的小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）與野生型MEF進行比較，觀察PGAM1的表達及酶活性變化，并加入mTOR抑制劑雷帕霉素進行進一步驗證。ELT3是Tsc2缺失的細胞系，其mTOR通路也是活化的，我們通過使用雷帕霉素處理或在ELT3中轉入TSC2來抑制mTOR通路，進一步觀察PGAM1表達與酶活性的變化。此外，我們在 Tsc2雜合小鼠腎臟腫瘤與野生型小鼠腎臟組織中比較了PG

5、AM1的表達。同時，我們在人肺癌組織及癌旁組織中觀察PGAM1的表達。最后，在Tsc2-/-、Pten-/-MEF中穩(wěn)定敲低缺氧誘導因子1α（Hypoxia inducible factor1α，HIF1α）來檢測mTOR是否通過HIF1α來調節(jié)PGAM1表達，并通過染色質免疫共沉淀實驗（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）驗證HIF1α對PGAM1的表達調控。結果顯示：PGAM1的蛋白表達和酶活性在m

6、TOR通路活化的MEF中升高。ELT3細胞中恢復TSC2表達或加入雷帕霉素可以降低PGAM1的表達和酶活性。PGAM1蛋白的上調也存在于Tsc2雜合小鼠的腎臟腫瘤組織和人肺癌組織。mTOR通路活化MEF中敲低HIF1α可下調PGAM1表達，ChIP進一步證明了mTOR通路通過HIF1α介導的轉錄激活來上調PGAM1的表達。
　　第二部分，利用RNA干擾技術在Tsc2-/-和Pten-/-MEF中敲低PGAM1，觀察細胞葡萄糖消耗和

7、乳酸生成，即Warburg效應的變化。同時利用細胞增殖實驗和克隆形成實驗，觀察PGAM1敲低后對細胞增殖能力和克隆形成能力的影響。將Pten-/-PGAM1敲低的MEF與對照MEF接種裸鼠，觀察兩組裸鼠的無瘤生存期和總生存期。結果顯示：PGAM1蛋白表達下降可以降低mTOR通路活化導致的Warburg效應，并且下調了細胞增殖能力和克隆形成能力。接種PGAM1敲低的Pten-/- MEF裸鼠無瘤生存期和總生存期均長于對照組裸鼠，說明PGA

8、M1在腫瘤形成及生長過程中起著重要作用。
　　第三部分，收集天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）術后癌組織與癌旁組織28對，檢測其PGAM1信使RNA（message RNA，mRNA）表達的不同。收集天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院227例 NSCLC和30例結直腸癌術后石蠟組織標本，應用免疫組織化學法檢測標本中PGAM1和磷酸化核糖體蛋白S6（Phospho-ribosoma

9、l proteinS6，pS6）表達，分析兩者之間的相關性及其與患者預后的關系。結果顯示：在NSCLC中，癌組織PGAM1的表達高于癌旁組織。在NSCLC與結直腸癌中，PGAM1高表達的患者總生存期（Overall survival，OS）和無進展生存期（Progressionfree survival，PFS）均較低表達的患者差，且PGAM1表達與mTOR通路活化具有顯著相關性。
　　綜上所述，得出以下結論：
　　1)mT