HIF-糖酵解-有氧氧化通路異常在非霍奇金淋巴瘤中的作用機制及干預研究.pdf

1、背景：傳統(tǒng)化療藥物大多針對快速分裂的細胞，因腫瘤細胞異質(zhì)性大，除快速增殖的腫瘤細胞群落外，尚存在增殖緩慢的腫瘤細胞群落，此外，正常組織細胞中同樣存在不斷分裂增殖的細胞。因此單純應用傳統(tǒng)化療藥物往往面臨著療效有限且殺傷正常組織細胞等不足。因此如何增加藥物的靶向性，提高藥物療效以及安全性顯得尤為重要。20世紀20年代提出的Warburg效應發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的代謝特征：即使在有氧環(huán)境下，腫瘤細胞依然依賴糖酵解而非有氧氧化來滿足腫瘤自身的能量及生物

2、合成需求。腫瘤細胞的有氧糖酵解與腫瘤形成的因果關系尚存爭議，在淋巴瘤中的研究正逐步開展。有研究表明，腫瘤細胞代謝表型的改變?yōu)镻I3K/Akt/mTOR、HIF-1α以及原癌基因c-MYC等基因主動調(diào)控的代謝重編程所致，而非腫瘤細胞因有氧氧化主要結(jié)構(gòu)線粒體受損而導致的被動應答，且此種代謝表型偏倚可逆。
　　目的：初發(fā)彌漫大B細胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma，DLBCL）患者腫瘤組織中HIF-1α

3、、糖酵解及有氧氧化相關關鍵蛋白表達與患者的預后分析；糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose，2DG）、mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）增加彌漫大B細胞淋巴瘤SUDHL-4與 Burkitt淋巴瘤Raji細胞株對阿霉素（Doxrubicin，DOX）敏感性的機制研究，以及分別聯(lián)用有氧氧化抑制劑寡霉素（Oligomycin，OM）探究雙代謝通路抑制對化療藥DOX的增敏作用；探究蛋白酶體抑制

4、劑硼替佐米（Bortezomib，BTZ）單獨應用及聯(lián)用OM后對SUDHL-4與Raji細胞株的作用機制。
　　方法：對83例初發(fā)DLBCL患者免疫組化、血清生化、PET/CT代謝活性等進行回顧性分析，檢測患者淋巴瘤組織中糖酵解及有氧氧化通路相關蛋白低氧誘導因子（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、己糖激酶（hexokinaseⅡ，HKⅡ）與琥珀酸脫氫酶（succinodehydrogenase

5、，SDHA）蛋白表達水平并進行預后分析。為研究2DG與RAPA是否增加DLBCL與Burkitt淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）細胞株對DOX的敏感性；RAPA是否同樣具有抑制糖酵解途徑的作用；以及聯(lián)用有氧氧化抑制劑OM后通過對糖酵解與有氧氧化的雙重抑制，是否更加顯著增敏DOX對彌漫大B細胞淋巴瘤SUDHL-4與Burkitt淋巴瘤Raji細胞株的殺傷作用；首先體外培養(yǎng)SUDHL-4與Raji細胞，以正常人外周血淋巴細胞

6、為對照，CCK8法檢測OM與RAPA對正常淋巴細胞及淋巴瘤細胞的增殖抑制率；將2DG、RAPA與DOX聯(lián)合作用，以及在OM與RAPA合用背景下與DOX聯(lián)合作用于SUDHL-4及Raji細胞株，應用CCK8法檢測細胞增殖抑制率；Glucose（HK）Assay Kit檢測葡萄糖消耗、乳酸（Lactic acid，LD）測試盒檢測乳酸含量及Succinate Colorimetric Assay Kit檢測琥珀酸生成； Western Bl

7、ot檢測HIF-1α及其下游血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及糖酵解途徑關鍵酶HKⅡ、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDHA）及有氧氧化關鍵酶SDHA蛋白表達水平；反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR（Reverse transcription and quantitative real-time PCR，RT-qPCR）檢測HIF-1α、HKⅡ、LDHA及SD

8、HA基因轉(zhuǎn)錄水平；流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡、PI單染法檢測細胞周期。為探索BTZ與OM聯(lián)用對DLBCL與BL細胞株的作用效應及機制，將不同濃度BTZ單用及與OM聯(lián)用于Raji和SUDHL-4細胞，CCK-8法檢測細胞增殖抑制率；代謝試劑盒檢測葡萄糖、乳酸和琥珀酸濃度；RT-qPCR檢測代謝途徑關鍵酶及蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平變化；Western blot法檢測蛋白表達水平；流式細胞術分析細胞凋亡。

9、　　結(jié)果：83例初發(fā)DLBCL患者回顧性分析，單因素分析顯示初發(fā)DLBCL患者Ki67、LDH、PET/CT檢測SUVmax、IPI、Ki67hiBCL-2+、HIF-1α、HKⅡ與SDHA等與PFS和OS顯著相關。HIF-1α、HKⅡ、SDHA均異常表達組（HIF-1α+ HKⅡhi SDHAlo，H-H-S）與不全異常表達組（non H-H-S），兩組間的預后危險因素LDH、Ki67、初發(fā)SUVmax、IPI評分均具有顯著的組間差異

10、（P<0.05）。H-H-S組與non H-H-S組的3年PFS率分別為14.3％與78.3%（P=0.001），3年OS率分別為14.3%與89.9%（P=0.000）。CCK8法測得RAPA作用48 h對淋巴瘤細胞株Raji和SUDHL-4的IC50值分別為（148.198±0.007）nM與（139.866±6.812）nM；OM作用48 h對Raji和SUDHL-4細胞的IC50值分別為（0.306±0.040）μg/ml和（0

11、.331±0.004）μg/ml。而RAPA與OM對正常淋巴細胞的IC50值分別為（608.698±20.324）nM和（2.058±0.932）μg/ml，顯著高于其對淋巴瘤細胞株的IC50值（P<0.01）。2DG及RAPA分別與DOX聯(lián)用均可協(xié)同抑制淋巴瘤細胞增殖；抑制細胞葡萄糖攝取及乳酸生成。研究發(fā)現(xiàn)RAPA對糖酵解及其聯(lián)用DOX具有更加顯著的抑制效果，因此后續(xù)選用RAPA作為糖酵解抑制劑與有氧氧化抑制劑OM聯(lián)用，通過同時抑制糖

12、酵解與有氧氧化的雙代謝途徑繼而聯(lián)用 DOX，上述抑制作用則更加顯著，此外與糖酵解及有氧氧化相關關鍵基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及細胞周期和細胞凋亡均被顯著協(xié)同抑制。蛋白酶體抑制劑BTZ單藥作用SUDHL-4及Raji細胞可顯著抑制細胞增殖且呈劑量依賴性；不同程度抑制原癌基因c-MYC、HIF-1α及其下游VEGF和GLUT1、糖酵解關鍵酶（HKⅡ、LDHA）以及有氧氧化關鍵酶（SDHA）的轉(zhuǎn)錄與翻譯；抑制葡萄糖消耗、糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸及有氧氧化代

13、謝產(chǎn)物琥珀酸生成；促進腫瘤細胞凋亡且呈劑量依賴性。與有氧氧化抑制劑OM聯(lián)用時，以上抑制作用顯著協(xié)同增強。
　　結(jié)論：以HIF-1α、HKⅡ、SDHA為代表的HIF-1α-糖酵解-有氧氧化通路在初發(fā)DLBCL患者中的異常表達可預測患者預后。糖酵解抑制劑2DG、mTOR抑制劑RAPA及蛋白酶體抑制劑BTZ均有顯著抑制淋巴瘤細胞糖酵解的作用，與傳統(tǒng)化療藥DOX聯(lián)用可通過下調(diào)HIF-1α從而有效抑制SUDHL-4及Raji細胞株糖酵解通路

14、，進而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。且在與OM作用條件下，通過對糖酵解及有氧氧化的雙重抑制，其抑制細胞的能量代謝與增殖以及促進細胞凋亡的作用顯著優(yōu)于代謝單通路抑制，協(xié)同機制可能與聯(lián)用后同時抑制糖酵解及有氧氧化兩條代謝途徑有關。以上均提示抑制雙代謝通路可能成為治療非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin Lymphoma，NHL）的新策略。提示 HIF-1α-糖酵解-有氧氧化通路異常可能是非霍奇金淋巴瘤的重要特點，RAPA聯(lián)合OM有望作為雙代謝通路抑