熱休克蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)及機(jī)理研究.pdf

1、淋巴瘤是血液科常見(jiàn)疾病，占每年新發(fā)腫瘤病例的5％，腫瘤死亡病例的3％。近30年來(lái)其發(fā)病率增高了2倍，導(dǎo)致這種情況的原因尚不明確。在所有的惡性淋巴瘤中非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）約占80％。多數(shù)NHL治療效果較霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma，HL）差。聯(lián)合化療及美羅華等靶向治療雖然可以使NHL生存期明顯延長(zhǎng)，但仍有部分患者復(fù)發(fā)、耐藥并最終死亡。因此迫切需要對(duì)NHL發(fā)病機(jī)理進(jìn)行更

2、深入研究，以期發(fā)現(xiàn)更有效的治療手段和措施。 熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）廣泛存在于多種細(xì)胞內(nèi)，在熱刺激、缺氧、創(chuàng)傷、氧化應(yīng)激、藥物等各種應(yīng)激誘導(dǎo)下表達(dá)增加。通過(guò)參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、伸展、轉(zhuǎn)運(yùn)和跨膜等過(guò)程HSPs發(fā)揮其“分子伴侶”功能，使細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激的能力增強(qiáng)。HSPs還具有抗凋亡的作用，它可以抑制凋亡通路中的多種蛋白，從而在凋亡通路的不同階段阻斷凋亡的發(fā)生。此外HSPs與腫瘤免疫也有密切的相

3、關(guān)，研究表明HSPs能加強(qiáng)腫瘤的免疫原性，參與呈遞腫瘤抗原，激發(fā)腫瘤免疫反應(yīng)。 由于在多種腫瘤細(xì)胞及組織中有高水平表達(dá)，并且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)行為及預(yù)后有密切的關(guān)系，HSPs可以作為判斷病情和預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)。部分研究還將HSPs作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。在體外實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用反義寡核苷酸或siRNA特異性抑制HSPs的表達(dá)，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)化療敏感性。HSP90的抑制劑17-AAG在一期臨床實(shí)驗(yàn)中顯示了良好的療效，目前已經(jīng)進(jìn)

4、入二期臨床實(shí)驗(yàn)。上述以HSPs為靶點(diǎn)的治療為我們更好的治療惡性疾病提供了新思路。 在多數(shù)腫瘤中HSPs高表達(dá)是分期晚、治療效果不佳和預(yù)后差的標(biāo)志，但是HSPs在NHL中的相關(guān)表達(dá)通路及與疾病的生物學(xué)行為之間的關(guān)系目前仍不明確。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)探討HSPs與淋巴瘤臨床表現(xiàn)、惡性程度及治療效果之間的相關(guān)性，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)分析NHL Raji細(xì)胞中HSP70作用的相關(guān)通路和機(jī)理，希望對(duì)淋巴瘤的生物學(xué)特征有更深入的了解，為疾病的

5、診斷和治療服務(wù)。 論文一 PI3K/AKT通路在熱處理誘導(dǎo)Raji細(xì)胞表達(dá)HSP70中的作用 目的：熱療和化學(xué)治療以及放射治療聯(lián)合可以用來(lái)治療多種腫瘤。但是熱療的應(yīng)用價(jià)值受到許多因素的影響，其中之一就是熱休克反應(yīng)。熱休克反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)高度保守的分子應(yīng)激反應(yīng)，在這一過(guò)程中熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）表達(dá)增加。而HSPs可以保護(hù)細(xì)胞免于一系列化學(xué)、物理和生物應(yīng)激原的損傷。熱休克蛋白70（Hea

6、t Shock Protein70，HSP70）是熱休克蛋白家族最主要的成員之一。研究表明HSP70對(duì)凋亡有抑制作用，HSP70表達(dá)增加可以減少化療藥物及射線誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。因此熱處理誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)增高，可能會(huì)對(duì)抗腫瘤治療產(chǎn)生不良影響。HSP70的表達(dá)主要受熱休克因子1（Heat shock factor1，HSF1）的調(diào)控。最新研究顯示PI3K可以影響HSF1的活性，進(jìn)而影響HSP70的表達(dá)。抑制PI3K/AKT通路后，細(xì)胞

7、內(nèi)HSP70表達(dá)降低。因此PI3K/AKT通路可能成為一個(gè)新的抑制HSP70表達(dá)的靶點(diǎn)。本研究利用LY294002（一種PI3K抑制劑）抑制PI3K/AKT通路，以探討該通路在熱處理誘導(dǎo)Raji細(xì)胞表達(dá)HSP70過(guò)程中的作用，并檢測(cè)熱處理誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)對(duì)Raji細(xì)胞凋亡和化療敏感性的影響。 方法：根據(jù)細(xì)胞處理的不同方式，實(shí)驗(yàn)分為3組： 1）對(duì)照組：Raji細(xì)胞不經(jīng)過(guò)熱處理，直接加用化療藥物作用； 2）熱處理

8、組：Raji細(xì)胞首先經(jīng)42℃熱處理，隨后在37℃培養(yǎng)4h，然后加入化療藥物作用； 3）LY294002預(yù)處理后加熱處理組：細(xì)胞首先經(jīng)LY294002預(yù)處理，隨后按照2組的方法處理。 用Western blotting分析不同處理后HSP70，AKT和P-AKT的表達(dá)。用AnnexinⅤ-PI雙染來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。用WST-8法檢測(cè)ADM和DDP對(duì)Raji細(xì)胞的毒性。 結(jié)果： 1.PI3K抑制劑抑制熱

9、處理誘導(dǎo)的HSP70表達(dá) 42℃熱處理后2小時(shí)即有HSP70的表達(dá)增加。熱處理后8小時(shí)，Raji細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)達(dá)到最高峰。在加熱處理后24小時(shí)，HSP70表達(dá)仍然高于對(duì)照組。熱處理后4小時(shí)HSP70表達(dá)明顯增加，同時(shí)伴有AKT活化（P<0.05）。而如果在熱處理前用LY294002預(yù)處理細(xì)胞，則HSP70表達(dá)及AKT活化明顯減弱（P<0.05）。 2.熱處理使Raji細(xì)胞抵抗DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 42℃熱處

10、理后24小時(shí)，Raji細(xì)胞凋亡率從6.44±0.64％上升到6.95±0.57％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。用5ug/ml和10ug/ml DDP單獨(dú)處理Raji細(xì)胞24小時(shí)，分別誘導(dǎo)了14.1％±0.5％和16.9％±1.14％的凋亡率。而如果在熱處理后應(yīng)用DDP，則凋亡率下降到9.73％±0.28％和10.50％±0.85％（P<0.01）。 3.PI3K抑制劑可以抵消熱處理對(duì)Raji細(xì)胞的保護(hù)作用 熱處理前

11、分別應(yīng)用10umol和20umol的LY294002來(lái)抑制HSP70的表達(dá)，觀察細(xì)胞凋亡率的改變。與未用LY294002相比，應(yīng)用LY294002后5ug/ml DDP誘導(dǎo)的凋亡率有了明顯的升高。10umol和20umolLY294002分別將凋亡率從9.73％±0.28％提高到15.33％±0.45％和19.5％±0.75％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 4.PI3K抑制劑增強(qiáng)了熱處理后Raji細(xì)胞對(duì)ADM和DDP的敏感

12、性 在經(jīng)42℃加熱預(yù)處理后，Raji細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性明顯下降，IC50從5.2ug/ml上升到17.0ug/ml。而如果在熱處理前應(yīng)用LY294002處理細(xì)胞，則可以顯著增強(qiáng)ADM的敏感性，并且呈計(jì)量依賴性。10umol、20umol和40umolLY294002分別使ADM的IC50下降至10.6 ug/ml、8.8ug/ml和3.6ug/ml。應(yīng)用DDP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，趨勢(shì)與上述結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.本研究首

13、次證實(shí)在熱誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞內(nèi)存在PI3K/AKT/HSP70表達(dá)通路。PI3K抑制劑LY294002可以抑制熱處理誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)。本研究為抑制Raji細(xì)胞中熱誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)提供了新思路。 2.適當(dāng)溫度的熱處理對(duì)Raji細(xì)胞有保護(hù)作用。當(dāng)熱處理誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)被抑制后，該保護(hù)作用減弱甚至消失。因此熱處理對(duì)Raji細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)HSP70表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 論文二熱休克蛋白70、90α在非霍奇金淋

14、巴瘤中的表達(dá)及臨床意義 目的：HSP70和HSP90是熱休克蛋白家族中兩個(gè)最重要同時(shí)也是研究最深入的成員。多種腫瘤組織中有HSP70和HSP90的表達(dá)，并且與腫瘤的分期和預(yù)后相關(guān)。但是在不同腫瘤中HSP70和HSP90所體現(xiàn)的意義不盡相同，部分研究的結(jié)果甚至是相互矛盾的。這可能與腫瘤的特異性有關(guān)。有研究表明在淋巴瘤細(xì)胞中有HSP70和HSP90表達(dá)，但未能明確兩者表達(dá)與淋巴瘤臨床表現(xiàn)和治療效果的關(guān)系。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)

15、兩種熱休克蛋白HSP70和HSP90α在NHL、壞死性淋巴結(jié)炎和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中的表達(dá)并探討其意義。 方法：選取資料完整的NHL病例30例；年齡6～84歲，平均年齡43.6歲。所有標(biāo)本均經(jīng)兩位病理學(xué)專家重新閱片證實(shí)。按Ann Arbor分期法對(duì)NHL進(jìn)行分期。參照美國(guó)國(guó)立癌癥研究所工作分型（1982年）進(jìn)行病理分型。10例壞死性淋巴結(jié)炎和12例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織作為對(duì)照。用免疫組化法檢測(cè)HSP70和HSP90α在三種組織

16、中的表達(dá)。HSP70及HSP90α均以細(xì)胞核或胞漿黃染為陽(yáng)性。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：≤5％為（-），6～25％為（+），26～50％為（++），>50％為（+++）；（+++）為高表達(dá)。 結(jié)果：HSP70、90α均表達(dá)于NHL細(xì)胞胞漿和胞核。在NHL、壞死性淋巴結(jié)炎和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中兩種熱休克蛋白均有高水平的表達(dá)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HSP70和HSP90α陽(yáng)性表達(dá)與NHL惡性程度，分期，有無(wú)B癥狀，是否累計(jì)

17、結(jié)外及治療效果均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。HSP70高表達(dá)（陽(yáng)性率大于50％）與NHL惡性程度，分期及治療效果密切相關(guān)（P<0.05），與是否有B癥狀、是否累及結(jié)外無(wú)關(guān)（P>0.05）。HSP90α高表達(dá)與上述指標(biāo)無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論： 1.本研究首次應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了HSP70在NHL中表達(dá)情況，并證實(shí)在NHL組織中HSP70的高表達(dá)率與NHL惡性程度、分期及治療效果相關(guān)。因此HSP70可以作為判斷NH