PGAM1調(diào)控糖酵解流誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞耐紫杉醇的機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的三大惡性腫瘤之一，而致死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首，嚴(yán)重危害女性健康。二十一世紀(jì)初以來，由于紫杉醇等新型化療藥物的問世及廣泛引進(jìn)中國，使得卵巢癌的近期完全緩解率明顯提高，但是總體死亡率并沒有減少。化療耐藥是晚期卵巢癌患者治療失敗和死亡的最主要原因之一。破解紫杉醇耐藥是提高卵巢癌患者生存率的關(guān)鍵。
　　紫杉醇作為抗微管藥物，是應(yīng)用最為廣泛的一線化療藥物，其抗腫瘤的機(jī)制是通過促進(jìn)微管蛋白聚合并且抑制蛋白聚

2、合體的解聚，使微管在細(xì)胞有絲分裂期失去應(yīng)有的活性，起到抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂的作用。證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞暴露紫杉醇后能夠通過一系列的適應(yīng)性改變逃避紫杉醇的殺傷，但相關(guān)的機(jī)制研究主要集中于微管相關(guān)分子突變或表達(dá)異常，微管穩(wěn)定性改變等使得紫杉醇與微管結(jié)合障礙，跨膜外流轉(zhuǎn)運蛋白的過表達(dá)所致的紫杉醇泵出增加以及凋亡相關(guān)分子的功能減弱等，但迄今未見針對這些機(jī)制而設(shè)計的策略應(yīng)用于臨床。腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出糖酵解增強(qiáng)的特性，而近期研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇的耐藥機(jī)制也可

3、能與糖酵解流增強(qiáng)相關(guān)。
　　增強(qiáng)的糖酵解流進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥可能有三方面的機(jī)制:第一，糖酵解流增強(qiáng)能使腫瘤細(xì)胞快速獲得能量取得生存優(yōu)勢;第二，線粒體呼吸功能受到抑制，氧化磷酸化途徑受到削弱，氧自由基產(chǎn)生減少，細(xì)胞逃避凋亡和自噬，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡減少;第三，糖酵解流增強(qiáng)的同時，其旁路磷酸戊糖途徑增強(qiáng)，產(chǎn)生的NADPH和磷酸核糖滿足了生物大分子特別是核酸合成的需要，用以修復(fù)損傷的DNA以及細(xì)胞的快速增殖。
　　本研究首先在

4、前期蛋白組學(xué)的基礎(chǔ)上，通過Western blot驗證PGAM1在卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞的高表達(dá)，并觀察紫杉醇對卵巢癌細(xì)胞PGAM1表達(dá)的誘導(dǎo)作用;采用siRNA干擾下調(diào)和pCMV4-PGAM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)PGAM1表達(dá)、及改變糖酵解的終產(chǎn)物-丙酮酸產(chǎn)量觀察對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的影響;最后利用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)、信息學(xué)分析及基因功能試驗，確定DDIT4蛋白可能參與PGAM1對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的調(diào)控。旨在從糖代謝途徑闡述卵巢癌耐

5、藥機(jī)制，為探索卵巢癌靶向治療的新途徑提供科學(xué)證據(jù)。
　　第一部分PGAM1表達(dá)及糖酵解流對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用目的:
　　通過觀察紫杉醇誘導(dǎo)對卵巢癌細(xì)胞PGAM1表達(dá)及糖酵解流的影響、及反向調(diào)控PGAM1表達(dá)和糖酵解流對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的影響，確定PGAM1及糖酵解流對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用。
　　方法:
　　本部分研究首先通過western blot證實PGAM1在耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞

6、亞系SKOV3-TR30和親本細(xì)胞SKOV3中的表達(dá)差異，通過紫杉醇刺激，觀察卵巢癌細(xì)胞PGAM1表達(dá)的變化。然后采用siRNA干擾下調(diào)PGAM1表達(dá)及用pcMV4-PGAM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)PGAM1表達(dá)，觀察卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的變化。最后，在耐紫杉醇細(xì)胞株和親本細(xì)胞株中，測定單位細(xì)胞糖酵解終產(chǎn)物-丙酮酸的產(chǎn)量并比較兩者差異，并且在培養(yǎng)基中逐漸增加丙酮酸的濃度，觀察細(xì)胞紫杉醇敏感性的改變。
　　結(jié)果:
　　1.卵巢癌耐紫杉

7、醇細(xì)胞株SKOV3-TR30的PGAM1表達(dá)較親本細(xì)胞高，紫杉醇刺激能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的PGAM1表達(dá)升高。
　　2.下調(diào)PGAM1表達(dá)使得卵巢癌細(xì)胞的紫杉醇敏感性增強(qiáng);上調(diào)PGAM1表達(dá)使得卵巢癌細(xì)胞的紫杉醇敏感性下降。
　　3.耐紫杉醇細(xì)胞株單位細(xì)胞糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸產(chǎn)量也比親本細(xì)胞顯著升高，培養(yǎng)基中添加一定濃度的丙酮酸或者乳酸能導(dǎo)致SKOV3的紫杉醇敏感性下降。
　　結(jié)論:
　　1.PGAM1參與

8、卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇敏感性的調(diào)控。
　　2.改變糖酵解終末產(chǎn)物濃度可影響PGAM1對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的調(diào)控。
　　第二部分參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性信號分子的篩選與驗證
　　目的:
　　通過RNA測序及生物信息學(xué)分析等，篩選并驗證參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性中的下游信號分子。
　　方法:
　　首先，我們在卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞株中通過siR-PGAM1轉(zhuǎn)染對目的分子PGAM1

9、進(jìn)行下調(diào)，western blot測定干擾效率滿意，將樣本準(zhǔn)備后送RNA-seq檢測(siRNA-PGAM1及陰性對照組，每組設(shè)3次生物學(xué)重復(fù))。提取出的細(xì)胞總RNA建立cDNA文庫后用Illumina Hi-seq 2000測序平臺進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)過比對分析后篩選出差異表達(dá)基因。然后對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG和GO聚類分析。最后在差異表達(dá)基因中利用GeneMANIA網(wǎng)絡(luò)在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出候選蛋白作為PGAM1調(diào)

10、控卵巢癌細(xì)胞的紫杉醇敏感性的關(guān)鍵分子。
　　結(jié)果:
　　1.RNA測序共得到除PGAM1外100個差異表達(dá)基因，其中包括43個上調(diào)基因，57個下調(diào)基因。
　　2.GO及KEGG聚類分析發(fā)現(xiàn)，代謝過程是主要的信號的通路。
　　3.生物信息學(xué)分析這100個差異表達(dá)基因所對應(yīng)的蛋白的互作結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，與PGAM1發(fā)生共表達(dá)的蛋白共有四個，分別為DDIT4、ADM、 AP3S1和和FTL，根據(jù)這四個蛋白的功能，DDIT4

11、作為下游信號分子參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的可能性最大。
　　4.在SKOV3-TR30細(xì)胞中，用siR-PGAM1下調(diào)PGAM1的表達(dá)后，在mRNA和蛋白水平驗證DDIT4的表達(dá)水平同時被下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.存在多個信號通路參與PGAM1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3紫杉醇敏感性的調(diào)控過程，其中代謝過程是主要的信號的通路。
　　2.DDIT4可能是參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的下游信號

12、分子。
　　第三部分 DDIT4參與PGAM1對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的調(diào)控
　　目的:
　　利用基因功能試驗和計算機(jī)模擬分子對接模型，確定DDIT4參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性，及P GAM1與DDIT4相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　采用siRNA干擾下調(diào)DDIT4表達(dá)及用pcDNA3.1-DDIT4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)DDIT4的表達(dá)，觀察卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的改變。并且，調(diào)節(jié)PGAM1

13、表達(dá)后，再反向調(diào)控DDIT4的表達(dá)，觀察PGAM1對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用能否被逆轉(zhuǎn)。
　　DDIT4是一個新近發(fā)現(xiàn)的蛋白，其三級結(jié)構(gòu)還沒有被解析。我們利用計算機(jī)同源建模的方法模擬DDIT4的蛋白三級結(jié)構(gòu)，并對DDIT4和已知三級結(jié)構(gòu)的PGAM1蛋白的對接進(jìn)行計算機(jī)模擬，預(yù)測DDIT與PGAM1蛋白相互作用的結(jié)合位點及蛋白-蛋白復(fù)合物穩(wěn)定性。
　　結(jié)果:
　　1.下調(diào)DDIT4表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇敏感

14、性，上調(diào)DDIT4表達(dá)可減弱卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇敏感性。
　　2.DDIT4能逆轉(zhuǎn)PGAM1對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用。
　　3.DDIT4以類似于遙爪的形式結(jié)合在PGAM1受體蛋白外，并與其氨基酸殘基發(fā)生強(qiáng)烈的氫鍵相互作用，兩者可能通過三個主要結(jié)合位點進(jìn)行穩(wěn)定結(jié)合，形成蛋白-蛋白復(fù)合物。
　　結(jié)論:
　　1.PGAM1通過與DDIT4相互結(jié)合對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性進(jìn)行調(diào)控。
　　2.PGAM1與D