新基因KIAA1529調(diào)控卵巢癌紫杉醇耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，也是婦科腫瘤惡性程度最高的疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年出現(xiàn)約22200個(gè)卵巢癌新診斷病例，同時(shí)超過約15000位卵巢癌患者出現(xiàn)死亡。卵巢癌的早期癥狀較為隱匿。當(dāng)發(fā)現(xiàn)診斷該疾病時(shí)，患者的病情已多發(fā)展為中晚期。目前卵巢癌的治療標(biāo)準(zhǔn)仍為手術(shù)治療后輔助以鉑類聯(lián)合紫杉醇的化療方案。但大部分患者最終出現(xiàn)對(duì)常規(guī)化療藥物耐藥，從而限制了化療藥物的治療效果。所以在過去的幾十年中，卵巢癌的5年生存率仍

2、徘徊在40％左右，并未出現(xiàn)明顯的改善。在臨床的治療過程中，卵巢癌患者的預(yù)后很大程度上取決于患者對(duì)治療的反應(yīng)性，化療方案的制定需根據(jù)患者的病情、手術(shù)經(jīng)過、病理診斷等多因素進(jìn)行綜合評(píng)估。而實(shí)行個(gè)體化的治療方案是目前國(guó)內(nèi)外婦科腫瘤醫(yī)師主要的研究目標(biāo)及方向。
　　紫杉醇作為卵巢癌治療的一線化療藥物，其主要的抗腫瘤作用為誘導(dǎo)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的微管聚合，產(chǎn)生穩(wěn)定的微管結(jié)構(gòu)，阻止有絲分裂過程中細(xì)胞染色體的正常排列及分離，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，最

3、終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。一般認(rèn)為，紫杉醇發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的重要機(jī)制是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞微管聚合，抑制腫瘤細(xì)胞微管解聚，使細(xì)胞分裂阻滯于G2/M期。
　　在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，通過RNAi文庫(kù)技術(shù)與蛋白質(zhì)免疫共沉淀，質(zhì)譜分析等蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方式相結(jié)合，在AKT/GSK-3β信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新基因KIAA1529可能參與了卵巢癌的紫杉醇耐藥。本研究旨在探討KIAA1529編碼蛋白KA在多種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，并通過藥物干預(yù)及RNA干擾技術(shù)探

4、討KA在GSK-3β信號(hào)通路中卵巢癌對(duì)紫杉醇耐藥的作用及相關(guān)機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌治療過程中出現(xiàn)的紫杉醇耐藥提供一個(gè)可能的新的分子治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　收集本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)腫瘤細(xì)胞系，用TRIzol法提取各腫瘤細(xì)胞系的總RNA，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)肺癌細(xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系及卵巢癌細(xì)胞系中KIAA1529基因mRNA水平的表達(dá)，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞系中KIAA1529基因編碼蛋白KA的表達(dá)。
　　使用GS

5、K-3β特異性抑制劑LiCl通過磷酸化抑制GSK-3β，同時(shí)在紫杉醇的作用下，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同處理組卵巢癌SKOV3細(xì)胞中GSK-3β、p-GSK-3β、KA的蛋白表達(dá)變化。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化及各組細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的改變。采用對(duì)SKOV3細(xì)胞中的p-H3及α-tubulin進(jìn)行免疫熒光染色，觀察各組細(xì)胞中進(jìn)行有絲分裂細(xì)胞比例的變化及細(xì)胞骨架形態(tài)的改變。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組理組細(xì)胞的凋亡情況。
　　采用RNA

6、干擾技術(shù)，將KA siRNA轉(zhuǎn)染至卵巢癌SKOV3細(xì)胞，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染KA siRNA后對(duì)SKOV3細(xì)胞中KA表達(dá)的抑制效果。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)在使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，在紫杉醇作用下對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期及細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的變化。采用對(duì)對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞中p-H3及α-tubulin的熒光染色，觀察兩組間細(xì)胞有絲分裂細(xì)胞比例的變化及細(xì)胞骨架形態(tài)的改變。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞的凋亡

7、情況。
　　使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，在紫杉醇作用下，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞中有絲分裂紡錘體檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。采用RNA干擾技術(shù)，將KA siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)在使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，紫杉醇作用下，對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組有絲分裂紡錘體檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　采用RNA干擾技術(shù)，將Aurora B siRNA轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，用蛋白質(zhì)

8、印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染Aurora B siRNA后，對(duì)SKOV3細(xì)胞中Aurora B蛋白表達(dá)的抑制效果。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的變化。采用對(duì)p-H3及α-tubulin的熒光染色，觀察對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有絲分裂比例的變化及細(xì)胞骨架形態(tài)的改變。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KIAA1529基因在肺癌，乳腺癌及卵巢癌細(xì)胞系中均有表達(dá)。通過蛋

9、白質(zhì)印跡法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KIAA1529基因編碼蛋白KA在卵巢癌SKOV3、A2780、C13K及OV2008細(xì)胞系中均有表達(dá)。在卵巢病變組織中，良性病變組織中KA的表達(dá)高于惡性腫瘤組織，并且在惡性病變組中，低分化腫瘤組織中KA比高分化及中分化的腫瘤組織中表達(dá)明顯降低。
　　2.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)提示，GSK-3β特異性抑制劑LiCl能明顯增加p-GSK-3β蛋白的表達(dá)。同時(shí)LiCl及紫杉醇共同處理組，比單獨(dú)使用紫杉醇處理組KA蛋白的表

10、達(dá)明顯升高。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后能減弱紫杉醇對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的G2/M期阻滯，同時(shí)有絲分裂指數(shù)降低。通過免疫熒光技術(shù)觀察，SKOV3細(xì)胞在LiCl與紫杉醇共同作用下，相對(duì)于單用紫杉醇處理，阻滯于有絲分裂狀態(tài)的細(xì)胞比例明顯減少；同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞分裂期濃縮核結(jié)構(gòu)及圓形細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的細(xì)胞比例明顯減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LiCl與紫杉醇共同作用組，凋亡率較單用紫杉醇處理組降低。兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

11、
　　3.熒光實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染KA siRNA后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞中KA的mRNA與蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，對(duì)KA表達(dá)的抑制效果明顯。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，同樣在LiCl與紫杉醇的作用下，轉(zhuǎn)染組G2/M期阻滯較對(duì)照組明顯，同時(shí)有絲分裂指數(shù)升高。通過免疫熒光技術(shù)觀察，在LiCl與紫杉醇共同作用下，轉(zhuǎn)染組阻滯于有絲分裂狀態(tài)的細(xì)胞比例升高；通過對(duì)α-tubulin的熒光染色發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)細(xì)胞分裂期

12、濃縮核結(jié)構(gòu)及圓形細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的細(xì)胞比例明顯升高。且流式細(xì)胞儀檢測(cè)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯升高。組間差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，在紫杉醇作用下，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)有絲分裂紡錘體檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)蛋白Aurora A、Aurora B、BUBR1、MAD2、CDC20，結(jié)果顯示使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，在紫杉醇作用下，MAD2及CDC20的表達(dá)無明顯變化，僅有Aurora

13、A、Aurora B、BUBR1蛋白出現(xiàn)相應(yīng)的表達(dá)變化。在LiCl與紫杉醇共同作用下，相對(duì)于單用紫杉醇，Aurora A、Aurora B、BUBR1蛋白的表達(dá)均下調(diào)。轉(zhuǎn)染KA siRNA后，在LiCl與紫杉醇的聯(lián)合作用下，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，Aurora A與BUBR1蛋白的表達(dá)無明顯改變，而Aurora B蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)染組抑制KA表達(dá)后上調(diào)。
　　5.蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Aurora B siRNA后，卵巢癌SKOV3細(xì)

14、胞中Aurora B蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，對(duì)Aurora B表達(dá)的抑制效果明顯。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，單用紫杉醇處理后，相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有絲分裂指數(shù)下降。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染組處于有絲分裂狀態(tài)的細(xì)胞減少，同時(shí)轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)細(xì)胞分裂期濃縮核結(jié)構(gòu)及圓形細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的細(xì)胞比例明顯減少。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染Aurora B siRNA后，在紫杉醇的作用下，凋亡率下降。
　　結(jié)論:
　　

15、新基因KIAA1529編碼及其編碼蛋白KA在卵巢癌細(xì)胞系中均有不同程度的表達(dá)。在卵巢病變組織中發(fā)現(xiàn)的KA表達(dá)差異顯示，新基因KIAA1529編碼蛋白KA與卵巢癌的分化有密切關(guān)系。
　　在GSK-3β信號(hào)通路中，通過GSK-3β特異性抑制劑LiCl作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞，使細(xì)胞中的GSK-3β磷酸化從而達(dá)到抑制GSK-3β的效果。當(dāng)細(xì)胞中的GSK-3β通過磷酸化被抑制后，在紫杉醇的作用下，SKOV3細(xì)胞中KA蛋白的表達(dá)升高，同時(shí)

16、出現(xiàn)紫杉醇所誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞G2/M期阻滯的效應(yīng)減弱，使腫瘤細(xì)胞從紫杉醇所誘導(dǎo)的有絲分裂阻滯狀態(tài)中逃逸，最終紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌腫瘤細(xì)胞凋亡減少，從而產(chǎn)生對(duì)紫杉醇的耐藥。
　　而當(dāng)通過RNA干擾技術(shù)抑制KA蛋白的表達(dá)后，逆轉(zhuǎn)了上述通過LiCl磷酸化抑制GSK-3β產(chǎn)生的卵巢癌SKOV3細(xì)胞的紫杉醇耐藥現(xiàn)象。說明通過磷酸化抑制GSK-3β所出現(xiàn)的卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥機(jī)制，可能是通過新基因編碼蛋白KA的表達(dá)升高產(chǎn)生的。

17、>　　實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，GSK-3β通過LiCl磷酸化被抑制后，在紫杉醇的作用下KA表達(dá)升高的同時(shí)，抑制了染色體過客蛋白復(fù)合物之一Aurora B蛋白的表達(dá)；而當(dāng)通過RNA干擾技術(shù)抑制KA蛋白的表達(dá)，Aurora B蛋白的表達(dá)恢復(fù)。說明了KA表達(dá)的升高抑制了染色體過客蛋白Aurora B的表達(dá)，破壞了有絲分裂紡錘體檢測(cè)點(diǎn)的功能，從而使細(xì)胞逃逸了紫杉醇誘導(dǎo)的有絲分裂阻滯，造成卵巢癌腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次在卵