SPARC調(diào)節(jié)糖酵解影響肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性的研究.pdf

1、目的：探討肝細(xì)胞癌中SPARC對(duì)糖酵解的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制，為SPARC作用于5-Fu耐藥的肝癌細(xì)胞，使耐藥肝癌細(xì)胞對(duì)5-Fu重新敏感的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：本研究選取HepG2,Hep3B,Huh7三株肝癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染SPARC或siRNA SPARC后,應(yīng)用比色法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的三株肝癌細(xì)胞中葡萄糖攝取量以及乳酸生成量以及糖酵解轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1和關(guān)鍵酶HKⅡ、LDHA的活性變化；應(yīng)用低濃度逐漸遞增的5-

2、FU誘導(dǎo)生成耐藥HepG2細(xì)胞；Western blotting法檢測(cè)缺糖條件下SPARC、AMPK、Thr-172 AMPK的表達(dá)情況，及5-FU耐藥HepG2細(xì)胞和敏感細(xì)胞中糖酵解代謝關(guān)鍵酶的變化情況；RT-PCR法檢測(cè)糖酵解關(guān)鍵基因Glut1、HKⅡ、LDHA的mRNA水平；在耐藥細(xì)胞中敲除Glut1、HKⅡ、LDHA的表達(dá)，或轉(zhuǎn)染SPARC，或瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染SPARC與糖酵解關(guān)鍵基因Glut1、HKⅡ、LDHA，分別應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)拒染法

3、比較處理前后細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性的變化，并應(yīng)用該方法檢測(cè)缺糖環(huán)境下SPARC對(duì)于HepG2細(xì)胞活力的影響。
　　結(jié)果：過(guò)表達(dá)SPARC的肝癌細(xì)胞中葡萄糖攝取及乳酸生成量明顯下降，糖酵解轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1及關(guān)鍵酶HKⅡ、LDHA的活性下調(diào)，反之，轉(zhuǎn)染siRNA SPARC的肝癌細(xì)胞中糖酵解作用上調(diào)；過(guò)表達(dá)SPARC的HepG2細(xì)胞在缺糖條件下細(xì)胞活力下調(diào)幅度較對(duì)照組減少，同時(shí)AMPK、Thr-172 AMPK的表達(dá)上調(diào)；5-FU耐藥

4、肝癌細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵基因Glut1、HKⅡ、LDHA的mRNA水平及蛋白水平上調(diào)；5-FU作用于過(guò)表達(dá)SPARC的HepG2細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活力較對(duì)照組明顯下降；耐藥HepG2細(xì)胞中SPARC過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性提高，當(dāng)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染SPARC與糖酵解關(guān)鍵基因時(shí)，細(xì)胞對(duì)5-FU不再重新獲敏。
　　結(jié)論：肝細(xì)胞癌中，SPARC通過(guò)下調(diào)糖酵解的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1及關(guān)鍵酶HKⅡ、LDHA負(fù)性調(diào)控糖酵解作用；SPARC能夠促使肝