他克莫司對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及其5-FU敏感性的影響.pdf

1、該項(xiàng)研究在體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株的條件下，應(yīng)用5-FU誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株凋亡，在建立凋亡模型并確定5-FU誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系和時效關(guān)系基礎(chǔ)上，采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分析FK506聯(lián)合5-FU對肝癌細(xì)胞株增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，同時進(jìn)行NF-κB活化和細(xì)胞周期基因表達(dá)的相關(guān)研究，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)凋亡率的檢測和細(xì)胞周期變化的結(jié)果，綜合分析FK506聯(lián)合5-FU對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響及其作用機(jī)制，試圖從凋亡的角度，為肝癌患者肝移植服

2、用免疫抑制劑后，體內(nèi)殘存的癌細(xì)胞對化療敏感性的差異提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研究免疫抑制劑和抗腫瘤藥物相互作用探索一種實(shí)驗(yàn)方法，并為進(jìn)一步開展肝癌肝移植術(shù)后實(shí)施個體化免疫抑制方案和個體化化療方案的研究奠定基礎(chǔ)。 15-FU誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡模型的建立 目的 在體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的條件下，實(shí)驗(yàn)選用5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和DNA瓊脂糖凝膠電泳加以確認(rèn)，通過流式細(xì)胞儀測

3、定細(xì)胞凋亡率并進(jìn)行細(xì)胞周期分析，明確5-FU誘導(dǎo)凋亡的時效和量效關(guān)系，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法 1)、體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721。 2)、建立5-FU誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過HE染色、熒光顯微鏡和DNA瓊脂糖凝膠電泳等進(jìn)行凋亡鑒定的定性實(shí)驗(yàn)。 3)、流式細(xì)胞術(shù)對5-FU誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，明確5-FU誘導(dǎo)凋亡的時效關(guān)系和量效關(guān)系，觀察5-FU對細(xì)胞周期

4、的影響。 結(jié)果 5-FU可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。HE染色及熒光染色顯示凋亡細(xì)胞變小變圓，細(xì)胞核固縮、碎裂并濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，細(xì)胞膜呈泡狀膨出并可見凋亡小體形成；DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示：小劑量5-FU(50、75、100、200μg/ml)主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞DNA電泳后出現(xiàn)階梯狀(ladder)條帶；大劑量5-FU(300、400μg/ml)主要導(dǎo)致細(xì)胞壞死，抽提后的DNA電泳出現(xiàn)類似血涂片樣的連續(xù)性條帶

5、；流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示50、100、200μg/ml的5-FU作用24h后細(xì)胞凋亡率分別為13.2％±2.53％、21.7％±3.18％和35.9％±3.67％，與對照組相比差異有顯著性(p＜0.05)；100μg/ml的5-FU作用0h、24h、48h、72h后，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率分別為5.6％±1.12％、21.7％±3.18％、27.8％±3.54％和42.8％±3.98％；細(xì)胞周期分析顯示，5-FU作用細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例增

6、加，而S期細(xì)胞比例逐漸減少；然而隨5-FU濃度增加，各實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞比例逐漸增加，細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)呈遞增趨勢。 結(jié)論 體外培養(yǎng)條件下，小劑量5-FU可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞凋亡，這種作用具有時效和量效關(guān)系；流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)5-FU抗腫瘤作用方式之一為阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期；5-FU作用腫瘤細(xì)胞具有雙向性：在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡同時，也啟動了某些機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖，對抗細(xì)胞凋亡，其表現(xiàn)形式為S期細(xì)胞比例和細(xì)胞

7、增殖指數(shù)逐漸增加。 2FK506預(yù)處理對SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡及其對5-FU敏感性的影響 目的 從凋亡的角度探討免疫抑制劑(FK506)存在時體內(nèi)殘存的癌細(xì)胞對化療敏感性的差異，為臨床肝癌肝移植術(shù)后進(jìn)行化療和實(shí)施個體化免疫方案提供一定的理論依據(jù)。 方法 采用MTT法觀察不同劑量FK506對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響，繪制細(xì)胞增殖抑制的劑量效應(yīng)曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測FK506

8、對肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響以及FK506預(yù)處理后聯(lián)合5-FU對細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果 MTT顯示各濃度的FK506對SMMC-7721細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用(p＜0.05)，F(xiàn)K506濃度達(dá)100ng/ml以上時，抑制作用呈現(xiàn)急劇上升趨勢；SMMC-7721細(xì)胞24h自然凋亡率為4.0％±0.65％，不同濃度FK506作用24h后，各組凋亡率與對照組相比差異無顯著性(p＞0.05)；但細(xì)胞周期

9、分析顯示，隨FK506濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例增加，而S期細(xì)胞比例逐漸減少，與對照組相比差異有顯著性(p＜0.05)；不同濃度FK506預(yù)處理細(xì)胞2h增強(qiáng)了5-FU(100μg/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，24h細(xì)胞凋亡率分別為27.6％±3.42％、32％±3.65％和39％±3.83％，其上調(diào)作用隨FK506劑量增加而逐漸增強(qiáng)；細(xì)胞周期分析顯示，隨著FK506濃度增加，S期細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞增殖指數(shù)呈遞減趨勢。 結(jié)論

10、 FK506對SMMC-7721細(xì)胞的增殖有抑制作用；FK506預(yù)處理能增強(qiáng)該細(xì)胞系對5-FU的敏感性，這一作用可能與FK506和5-FU協(xié)同誘導(dǎo)凋亡和G0/G1期停滯有關(guān)。 35-FU及聯(lián)合FK506對核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 目的 明確5-FU及聯(lián)合FK506對NF-κB表達(dá)以及活化后入核的影響。 方法 Trans-AMNF-κBp65檢測試劑盒檢測5-FU及聯(lián)合用

11、藥后NF-κBp65亞基活化程度的差異；采用細(xì)胞爬片及免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察p65亞基核轉(zhuǎn)位及染色差異。 結(jié)果 Trans-AMNF-κBp65活性檢測顯示：空白對照組有一定的NF-κB活性表達(dá)；5-FU作用SMMC-7721細(xì)胞后，NF-κB活性明顯高于空白對照組；FK506預(yù)處理能明顯抑制NF-κB的活化，且抑制程度與FK506劑量增加而增強(qiáng)；NF-κB亞基p65免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：正常培養(yǎng)條件下，p65主要存在

12、于胞漿中，胞漿呈強(qiáng)陽性染色；5-FU作用能誘導(dǎo)p65亞基由胞漿移位至細(xì)胞核；隨5-FU劑量增加，SMMC-7721細(xì)胞核p65亞基染色逐漸增強(qiáng)，F(xiàn)K506預(yù)處理能明顯抑制活化的NFG-κB核染色，直觀地驗(yàn)證了NF-κB活性檢測顯示的結(jié)果。 結(jié)論 5-FU可能通過激活NF-κB啟動細(xì)胞抗凋亡機(jī)制；FK506有抑制NF-κB活化的作用；FK506預(yù)處理增強(qiáng)5-FU殺傷能力的作用機(jī)制可能與其阻斷NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

13、 45-FU及聯(lián)合FK506對周期蛋白基因D1表達(dá)的影響 目的 通過研究實(shí)驗(yàn)各組NF-κB下調(diào)靶基因CyclinD1表達(dá)差異并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)中細(xì)胞周期變化，進(jìn)一步探討FK506增強(qiáng)5-FU殺傷作用的機(jī)制。 方法 采用半定量RT-PCR和WesternBlotting的實(shí)驗(yàn)方法，檢測5-FU單獨(dú)作用及聯(lián)合FK506后CyclinD1mRNA和CyclinD1蛋白表達(dá)的差異。 結(jié)果

14、 RT-PCR檢測各組CyclinDlmRNA的表達(dá)顯示：5-FU作用SMMC-7721細(xì)胞后，CyclinD1mRNA表達(dá)水平顯著高于空白對照組；FK506預(yù)處理能抑制其表達(dá)，且抑制程度隨FK506劑量增加而增強(qiáng)；Western-Blotting檢測CyclinD1蛋白表達(dá)顯示：各實(shí)驗(yàn)組CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對照組；FK506預(yù)處理能抑制其表達(dá)，且FK506濃度越高，抑制效應(yīng)越明顯。 結(jié)論 5-FU

15、作用肝癌細(xì)胞時CyclinD1基因表達(dá)增強(qiáng)；CyclinD1過度表達(dá)可能是促進(jìn)細(xì)胞增殖、對抗細(xì)胞凋亡的重要因素之一；FK506預(yù)處理可下調(diào)CyclinD1基因和CyclinD1蛋白的表達(dá)，提示FK506能夠協(xié)同5-FU誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用可通過抑制NF-κB活性進(jìn)而下調(diào)CyclinD1基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。 綜上所述，該研究的初步結(jié)論如下： 1.在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，5-FU作用于肝癌細(xì)胞株SMMC-772

16、1，一方面可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，且其誘導(dǎo)凋亡作用具有時效和量效關(guān)系，細(xì)胞周期分析顯示5-FU作用使G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例逐漸減少，說明誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期是5-FU抗腫瘤活性的重要形式之一；另一方面，隨著5-FU劑量增加，S期細(xì)胞比例和細(xì)胞增殖指數(shù)也逐漸增加，提示5-FU誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的同時，也啟動了細(xì)胞自身抗凋亡機(jī)制。 2.FK506有抑制肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞

17、增殖的作用；聯(lián)合應(yīng)用FK506和5-FU對誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用。 3.5-FU作用SMMC-7721細(xì)胞后，核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65亞基活化并移位至細(xì)胞核，隨5-FU劑量增加，SMMC-7721細(xì)胞核p65亞基染色逐漸增強(qiáng)；FK506預(yù)處理能抑制NF-κB的活化，且抑制程度隨FK506劑量增加而逐漸增強(qiáng)。 4.5-FU作用SMMC-7721細(xì)胞后，CyclinD1mRNA和蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，隨5-FU劑量增加，表達(dá)逐