藁本內(nèi)酯恢復(fù)ERα陰性乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬敏感性及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有補(bǔ)血、和血和調(diào)經(jīng)止痛等功效，自古以來(lái)多用于婦科方面疾病。揮發(fā)油為當(dāng)歸的主要活性成分之一，而藁本內(nèi)酯（Z-ligusilide，Z-LIG）是其揮發(fā)油的主要成分，約占50％以上。雌激素受體α（Estrogen receptor alpha，ERα）陰性表達(dá)（ERα-）患者在乳腺癌中約占30%，對(duì)傳統(tǒng)內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬（Tamoxifen，

2、TAM）不敏感，臨床預(yù)后不良，具有較高死亡率。近年發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯對(duì)結(jié)腸癌、前列腺癌、白血病以及腦腫瘤均具有抑制作用。但是關(guān)于其主要成分藁本內(nèi)酯用于 ERα-乳腺癌細(xì)胞方面的作用還未有報(bào)道。
　　目的：以三種 ERα-乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，探究當(dāng)歸揮發(fā)油與藁本內(nèi)酯是否能夠通過(guò)恢復(fù)ERα-乳腺癌細(xì)胞中ERα表達(dá)而增敏他莫昔芬的抑制作用，并對(duì)藁本內(nèi)酯如何恢復(fù)ERα及與他莫昔芬產(chǎn)生協(xié)同抑制作用的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，為當(dāng)歸及藁本內(nèi)酯用于ERα

3、-乳腺癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。
　　方法：在研究當(dāng)歸揮發(fā)油及藁本內(nèi)酯恢復(fù)他莫昔芬對(duì)ERα-乳腺癌細(xì)胞的抑制作用方面：首先，采用黃酰羅丹明B（SRB）法，以當(dāng)歸揮發(fā)油或藁本內(nèi)酯與他莫昔芬單獨(dú)或合用處理三種 ERα-乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231、HS578t和 MDA-MB-453）72h。同時(shí)，用苔盼藍(lán)拒染法和克隆形成實(shí)驗(yàn)考察了藁本內(nèi)酯與他莫昔芬對(duì)此三種細(xì)胞的增殖及克隆形成能力的影響。在進(jìn)一步的機(jī)制研究中，我們用流式細(xì)胞儀、

4、Hochest33342染色和Western blotting實(shí)驗(yàn)分別對(duì)凋亡和周期進(jìn)行了探究。在探究藁本內(nèi)酯對(duì)ERα表達(dá)的影響及ERα在藁本內(nèi)酯與他莫昔芬協(xié)同抑制活性中的作用方面：以當(dāng)歸揮發(fā)油與藁本內(nèi)酯分別處理此三種ERα-乳腺癌細(xì)胞，用Western blotting對(duì)ERα蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。此外，為檢恢復(fù)的ERα對(duì)雌激素應(yīng)答活性元件（ERE）活性的影響，我們采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了檢測(cè)。最后用ERα蛋白拮抗劑-氟維斯

5、群（ICI182780）及si-ERα方法，通過(guò)SRB、克隆形成等實(shí)驗(yàn)評(píng)估了所恢復(fù)的ERα在藁本內(nèi)酯與他莫昔芬協(xié)同作用中的地位。在藁本內(nèi)酯恢復(fù) ERα表達(dá)的機(jī)制方面：結(jié)合研究報(bào)道，我們從組蛋白 H3（lys9/14）的去乙?；嵌冗M(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。首先，我們用Western blotting檢測(cè)了藁本內(nèi)酯不同劑量和時(shí)間點(diǎn)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中Ace-H3（lys9/14）的表達(dá)影響。然后，用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）法觀察藁本內(nèi)酯對(duì)

6、細(xì)胞ERα啟動(dòng)子上Ace-H3（lys9/14）結(jié)合水平有無(wú)影響。其次，我們用Western blotting考察了能夠抑制ERα轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)因子MTA1、IFI16與HDACs（HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7）的表達(dá)情況，用ChIP法檢測(cè)了這些因子在ERα啟動(dòng)子上的結(jié)合情況。并給藥藁本內(nèi)酯檢測(cè)對(duì)它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)表達(dá)和在ERα啟動(dòng)子上結(jié)合的影響。同時(shí)，我們用基因過(guò)表達(dá)的方法，將MTA1、IFI16、HDAC1和HDAC7分別過(guò)表

7、達(dá)后，考察它們對(duì)藁本內(nèi)酯上調(diào)ERα的能力和藁本內(nèi)酯與他莫昔芬協(xié)同抑制作用所產(chǎn)生的影響。最后，我們通過(guò)免疫沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了藁本內(nèi)酯對(duì)以 MTA1為主體招募 IFI16與HDACs（HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7）因子所形成復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。
　　結(jié)果：當(dāng)歸揮發(fā)油與他莫昔芬處理三種ERα-乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231、HS578t和MDA-MB-453細(xì)胞）72h后，結(jié)果顯示二者單獨(dú)對(duì)此三種細(xì)胞的存活率均無(wú)明顯

8、抑制作用，但當(dāng)合用時(shí)，卻對(duì)此三種細(xì)胞均產(chǎn)生顯著抑制作用，其中MDA-MB-231最為敏感。隨后，考察藁本內(nèi)酯與他莫昔芬的作用，發(fā)現(xiàn)二者合用對(duì)此三種細(xì)胞的存活率亦顯示出類似的協(xié)同抑制作用，且同樣觀察到MDA-MB-231較另外兩種細(xì)胞更敏感。進(jìn)一步的苔盼藍(lán)拒染法和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示藁本內(nèi)酯與他莫昔芬合用可顯著抑制此三種細(xì)胞的增殖與克隆形成能力。在隨后的凋亡和周期機(jī)制探究中，流式細(xì)胞儀和Hochest33342染色得出藁本內(nèi)酯與他莫昔芬可以誘

9、導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生近2倍凋亡率，且細(xì)胞核明顯變亮和皺縮破碎。同時(shí)細(xì)胞的S和G2/M期發(fā)生明顯阻滯。而進(jìn)一步的Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，二者合用可以通過(guò)誘導(dǎo)凋亡標(biāo)志性蛋白 p53上升，進(jìn)一步促進(jìn)了 pro-PARP、pro-caspase3、cleaved-PARP和cleaved-caspase3轉(zhuǎn)換表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，還能夠通過(guò)上調(diào)Acetyl-p53與BRCA1表達(dá)，進(jìn)一步使p21上調(diào)，同時(shí)促進(jìn)周期阻滯蛋白p27而使與

10、S和G2/M期有關(guān)的CDK1、CDK2、Cyclin A與 Cyclin E蛋白含量下降而阻滯周期。用Western Blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油（10、20與40μg/mL）與藁本內(nèi)酯（10、25與50μM）均能恢復(fù)三種ERα-乳腺癌細(xì)胞中ERα的表達(dá)。且藁本內(nèi)酯上調(diào)ERα后能進(jìn)一步激活下游啟動(dòng)子ERE的活性，而單獨(dú)的他莫昔芬對(duì)其無(wú)作用，但他莫昔芬能阻斷藁本內(nèi)酯對(duì)ERE的激活。用氟維斯群（ICI182780）或si-ERα處理后

11、，由于降低了藁本內(nèi)酯對(duì)ERα的恢復(fù)，造成藁本內(nèi)酯與他莫昔芬的協(xié)同抑制作用被逆轉(zhuǎn)。在ERα恢復(fù)機(jī)制研究中，Western Blotting顯示隨著藁本內(nèi)酯（10、25與50μM）劑量及時(shí)間點(diǎn)（0、24、48與72h）增加，Ace-H3（lys9/14）蛋白含量逐漸增加。而參與組蛋白修飾的MTA1、IFI16與HDACs（HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7）蛋白均被下調(diào)。通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯（50μM）可以通過(guò)降低MT

12、A1、IFI16與HDACs（HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7）在ERα啟動(dòng)子上的富集，而增加Ace-H3（lys9/14）在ERα啟動(dòng)子的結(jié)合水平。進(jìn)一步過(guò)度表達(dá)MTA1、HDAC1、HDAC7與IFI16，我們發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯上調(diào)ERα的能力被減弱，同時(shí)，藁本內(nèi)酯與他莫昔芬的協(xié)同抑制作用也被反轉(zhuǎn)。最后，IP實(shí)驗(yàn)顯示， MTA1與其它因子均有相互結(jié)合。但藁本內(nèi)酯（50μM）給藥后，可能由于藁本內(nèi)酯降低了它們各自的表達(dá)而使得MTA

13、1與其它因子結(jié)合程度均明顯降低，從而影響了MTA1/IFI16/HDACs所形成的NuRD復(fù)合物穩(wěn)定性。
　　結(jié)論：藁本內(nèi)酯能夠通過(guò)降低MTA1、IFI16和 HDACs（ HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7）表達(dá)及在ERα啟動(dòng)子上的結(jié)合，而影響MTA1/IFI16/HDACs所形成的NuRD復(fù)合物穩(wěn)定性，使得ERα啟動(dòng)子上組蛋白H3（lys9/14）乙?；皆黾?，最終使ERα恢復(fù)表達(dá)，從而使他莫昔芬對(duì)ERα-乳腺癌細(xì)胞