他莫昔芬耐藥乳腺癌細胞的干細胞特性研究.pdf

1、雌激素能夠與乳腺組織的雌激素受體(estrogenreceptor,ER)結(jié)合從而促進乳腺組織的生長，由于這一功能，雌激素具有促進乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用。研究表明，大部分的乳腺癌組織表達ER，所以阻斷ER的轉(zhuǎn)導通路是治療各期乳腺癌的一個安全且有效的方法，這就是乳腺癌的內(nèi)分泌治療。1986年Beatson采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)治療乳腺癌患者并且取得了良好的療效，這是內(nèi)分泌治療方法的開始。近三十年來，ER拮抗劑他莫昔芬已經(jīng)成為了乳腺癌內(nèi)分泌治療中

2、最常見的治療藥物。但是隨之產(chǎn)生的問題是乳腺癌對他莫昔芬的耐藥性。研究表明，大約有三分之一的乳腺癌患者對內(nèi)分泌治療不敏感，而且部分最初對他莫昔芬敏感的乳腺癌患者，最終會產(chǎn)生對他莫昔芬的耐藥從而導致乳腺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移。盡管有大量的研究對這一現(xiàn)象進行了探討，但是其機制卻并不完全清楚。目前認為乳腺癌對他莫昔芬產(chǎn)生耐藥的機制主要有以下幾點:ER的改變，增強的生長因子通路，核受體共調(diào)節(jié)因子，對雌激素的超敏感，藥物的代謝變化等。此外，還有研究表明，腫瘤

3、干細胞(cancerstemcells，CSCs)有可能在乳腺癌的獲得性耐藥中發(fā)揮了重要的作用。
　　CSCs是腫瘤組織所包含的一小群具有自我更新能力和分化能力的細胞，由于CSCs的這種能力，CSCs被認為是產(chǎn)生腫瘤組織的細胞。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌CSCs(breastCSCs，BCSCs)具有對放療和化療耐藥的特性，也因此對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用，但是BCSCs在乳腺癌對他莫昔芬耐藥中的作用并不明確。到目前為止相關的研究很少

4、，但是我們推測BCSCs有可能參與了乳腺癌對他莫昔芬的耐藥作用，主要依據(jù)有以下兩點:在乳腺癌對他莫昔芬的耐藥過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)起了重要的作用;EMT和CSCs密切相關，被認為是CSCs的特性之一。
　　EMT是上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，起初在胚胎干細胞中發(fā)現(xiàn)。EMT過程中，上皮細胞之間的連接消失，細胞的運動性增加，從而導致腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究表明

5、，在乳腺癌細胞系MCF7對他莫昔芬產(chǎn)生耐藥的過程中，乳腺癌細胞的侵襲性和運動能力增加，并且伴隨著EMT的發(fā)生:間充質(zhì)樣細胞的形態(tài)改變，E-鈣粘蛋白的表達降低，N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達增加。EMT和CSCs之間的關系也得到了證明。對人乳腺上皮細胞系的研究表明，采用Twist和Snail誘導EMT以后，乳腺細胞表達了干細胞的標記物并且表現(xiàn)出微球體形成能力的增加。此外，Brca1基因缺陷小鼠分離的乳腺癌細胞呈現(xiàn)出EMT特點并且表達了CSC

6、s的標記物。
　　將上述這些研究結(jié)果結(jié)合起來，我們認為CSCs很有可能參與了乳腺癌細胞對他莫昔芬獲得性耐藥的機制。為了驗證上述推測，本研究建立了對他莫昔芬耐藥的乳腺癌上皮細胞系MCF7，并觀察了其是否具有CSCs的特性。
　　第一部分人乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞系的建立及鑒定
　　實驗方法：
　　1.采用持續(xù)低劑量法誘導耐他莫昔芬（tamoxifen-resistant，TAM-R）的MCF7細胞，時間持續(xù)8個月，誘

7、導藥物濃度始終保持在0.1μmol/L。
　　2.光鏡觀察細胞的形態(tài)，觀察誘導過程中細胞形態(tài)的變化。
　　3.采用細胞計數(shù)的方法檢測TAM-RMCF7細胞的增殖能力和倍增時間。
　　4.采用MTT法檢測TAM-RMCF7細胞對他莫昔芬的敏感性，測定耐藥指數(shù)。
　　5.流式細胞技術(shù)檢測在他莫昔芬存在的情況下，TAM-RMCF7和WTMCF7細胞的凋亡率，進一步確定TAM-RMCF7對他莫昔芬的敏感性。
　　實

8、驗結(jié)果：
　　1.TAM-RMCF7細胞表現(xiàn)為多邊形，細胞體積變小。
　　2.同正常MCF7(wildtype，WT)細胞相比，TAM-RMCF7細胞的增殖能力無顯著改變，倍增時間為41.4h，同WTMCF7細胞(42.3h)無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.培養(yǎng)液存在他莫昔芬（0.1μmol/l）的情況下，在第3、4、5和6天，TAM-RMCF7細胞的增長速率顯著高于WTMCF7細胞(P＜0.05)，但是在第1和

9、2天，兩者之間的生長速率無顯著差異。同正常培養(yǎng)液的WTMCF7細胞相比，TAM-RMCF7在含他莫昔芬(0.1μmol/l)培養(yǎng)液中的增殖速率無顯著改變(P＞0.05);在他莫昔芬濃度為0.0001、0.001、0.01、0.1和1μmol/L的情況下，TAM-RMCF7的增長速率同對照（無他莫昔芬的WTMCF7）相比，無顯著下降(P＞0.05)，但是WTMCF7細胞的增長速率呈現(xiàn)濃度依賴性的降低，而且在他莫昔芬濃度為0.01、0.1和

10、1μmol/L的情況下，TAM-RMCF7細胞的生長速率顯著高于WTMCF7細胞(P＜0.001)，TAM-RMCF7對他莫昔芬的耐藥指數(shù)為16.80。
　　4.流式細胞術(shù)顯示，在他莫昔芬(0.1μmol/L)存在的情況下，TAM-RMCF7細胞的凋亡率顯著低于WTMCF7細胞(P＜0.001)。
　　實驗結(jié)論：
　　1.成功建立了耐他莫昔芬的人乳腺癌細胞系TAM-RMCF7。
　　2.TAM-RMCF7呈現(xiàn)出耐

11、他莫昔芬的特性。
　　第二部分他莫昔芬耐藥乳腺癌細胞中腫瘤干細胞特性的鑒定
　　實驗方法：
　　1.流式細胞術(shù)檢測TAM-RMCF7細胞中的側(cè)亞群(sidepopulation，SP)。
　　2.檢測As2O3對細胞的毒性。
　　3.采用MTT法測定TAM-RMCF7細胞對他莫昔芬、順鉑和紫杉醇的敏感性，以及As2O3對TAM-RMCF7細胞耐藥性的影響。
　　4.實時定量RT-PCR檢測TAM-RM

12、CF7細胞Sox-2、mir-200c和let-7的表達以及As2O3對Sox-2、mir-200c和let-7的表達的影響。
　　5.微球體形成實驗檢測TAM-RMCF7細胞的微球體形成能力。
　　實驗結(jié)果：
　　1.流式細胞術(shù)顯示，TAM-RMCF7細胞中SP細胞的比例顯著高于WTMCF7細胞（P＜0.01）。
　　2.0.25mg/L的As2O3對WTMCF7和TAM-RMCF7細胞無毒性反應，但是當As2

13、O3濃度超過0.25mg/L時，細胞呈現(xiàn)出劑量依賴性的毒性效應。
　　3.0.20mg/L的As2O3降低了TAM-RMCF7對他莫昔芬的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.99，相對逆轉(zhuǎn)效率為81.1％。
　　4.順鉑的耐藥指數(shù)為6.99，As2O3降低了TAM-RMCF7對順鉑的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為4.03，相對逆轉(zhuǎn)效率為87.7％。
　　5.紫杉醇的耐藥指數(shù)為4.08，As2O3降低了TAM-RMCF7對紫杉醇的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)

14、為2.23，相對逆轉(zhuǎn)效率為70.2％。
　　6.相對于WTMCF7細胞，TAM-RMCF7細胞中Sox-2的表達顯著增強(P＜0.01)，mir-200c和let-7的表達顯著下降(P＜0.05)。As2O3預處理后，Sox-2的表達顯著降低（P＜0.05），mir-200c和let-7的表達顯著升高（P＜0.05）。
　　7.相對于WTMCF7細胞，TAM-RMCF7細胞形成的微球體數(shù)目顯著增多(P＜0.01)。
　

15、　實驗結(jié)論：
　　1.人乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞系TAM-RMCF7具有干細胞的特性。
　　2.TAM-RMCF7呈現(xiàn)出多藥耐藥性。
　　第三部分他莫昔芬耐藥乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的鑒定和生物學行為的研究
　　實驗方法：
　　1.光鏡觀察了TAM-RMCF7細胞的形態(tài)學改變，以確定細胞是否產(chǎn)生與EMT有關的形態(tài)學改變。
　　2.免疫印跡法檢測了上皮表型標志物E-鈣粘蛋白和間充質(zhì)表型特性分子N-鈣粘蛋白、

16、Snail以及波形蛋白的表達。
　　3.Transwell小室法觀察了TAM-RMCF7細胞的體外侵襲能力。
　　4.小鼠移植瘤實驗檢測了TAM-RMCF7細胞的致瘤能力。
　　實驗結(jié)果：
　　1.光鏡結(jié)果顯示，TAM-RMCF7細胞失去極性，呈現(xiàn)出多邊形態(tài)，細胞間黏附減少，細胞呈現(xiàn)散在分布，而WTMCF7細胞呈現(xiàn)出鵝卵石形態(tài)，而且細胞間黏附較多，細胞多以團樣聚集。
　　2.免疫印跡結(jié)果顯示，相對于WTMC

17、F7細胞，E-鈣粘蛋白在TAM-RMCF7細胞的表達顯著降低，而N-鈣粘蛋白、Snail和波形蛋白的表達顯著增加。As2O3預處理后，E-鈣粘蛋白的表達顯著升高，而N-鈣粘蛋白、Snail和波形蛋白的表達顯著降低。
　　3.WTMCF7細胞穿透Matrigel的平均細胞數(shù)為44.2±5.8，而TAM-RMCF7細胞穿透Matrigel的平均細胞數(shù)為134.8±11.9，顯著高于WTMCF7細胞(P＜0.001)。As2O3預處理后

18、，TAM-RMCF7細胞穿透Matrigel的平均細胞數(shù)顯著降低，大約為71.4±20.2(P＜0.001)。
　　4.小鼠移植瘤實驗顯示，將TAM-RMCF7細胞移植入裸小鼠60天后，其移植瘤大小約為956.7±162.5mm3，重量大約為601.0±146.1mg，而在WTMCF7細胞組，其移植瘤大小約為192.7±78.0mm3，重量大約為121.2±51.9mg，均顯著低于TAM-RMCF7細胞組(P＜0.01)。