一、GFRα2基因過表達慢病毒載體的構建與鑒定二、乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞株的建立及功能驗證.pdf

1、第一部分:GFRα2基因過表達慢病毒載體的構建和鑒定
　　目的:構建膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子受體α2基因（GlialCellLine-derived Neurotrophic Factor Receptor2，GFRα2）過表達慢病毒載體(Lentiviral vector，LV)，并對其進行病毒包裝與鑒定，為進行GFRα2基因體內外實驗奠定基礎。
　　方法: GenBank搜索GFRα2基因序列(Gene ID:2675，

2、序列號:NM_001495)，設計PCR(Real-time PCR)引物擴增目的基因，構建至過表達載體并轉化感受態(tài)細胞，進行測序驗證。成功進行驗證后，使其與慢病毒包裝質?；旌衔锕厕D染人腎上皮細胞293T，并包裝為慢病毒，待濃縮純化后檢測其滴度。
　　結果:測序結果與目標序列相一致，PCR鑒定產物大小1536bp，和預期值大小相同，Western blotting技術檢測觀察到55KD附近處有特征條帶，且與目的基因融合蛋白大小一致

3、，結果證實GFRα2正確插入到載體中，且過表達載體構建成功。感染人腎上皮細胞293T細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到熒光表達，收集病毒上清液，熒光法測定病毒的包裝滴度為2.0×108TU/ml。
　　結論:GFRα2基因過表達慢病毒載體構建成功，為研究其在乳腺癌內分泌治療的生物學功能奠定了基礎。
　　第二部分:乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞株的建立與功能驗證
　　目的:構建乳腺癌細胞系MCF-7他莫昔芬耐藥細胞株，并對其進行功能驗

4、證，探索GFRα2及HER2表達情況與其耐藥性的關系。
　　方法:1、4-OH他莫昔芬(OHT)誘導MCF-7乳腺癌細胞，顯微鏡下觀察比較不同誘導時間細胞形態(tài)學差異，制作生長曲線，比較細胞生長差異。2、CCK8試劑盒檢測藥物敏感試驗。計算不同誘導時間細胞的半數抑制濃度IC50及耐藥指數（RI）。3、細胞侵襲遷移實驗比較MCF-7細胞、OHT誘導第14天（MCF-714d）及第28天(MCF-728d)侵襲遷移能力。4、RT-PCR

5、檢測不同誘導時間細胞的GFRα2 mRNA及HER2 mRNA表達情況。Western blot檢測GFRα2、HER2蛋白表達情況。
　　結果:
　　1、MCF-7細胞呈鋪路石樣團簇生長團，形態(tài)呈橢圓形，體積中等，大小均勻，核仁清晰;使用OHT誘導7天，細胞團簇樣生長開始趨于松散，細胞形態(tài)開始出現變化，由圓形、橢圓形逐漸轉變?yōu)樾切巍⒍嘟切?誘導第14天，細胞松散，團簇樣生長不明顯，細胞形態(tài)明顯變化，呈星形、多角形、樹枝樣;

6、誘導28天后，細胞團簇樣生長不明顯，形態(tài)較扁平，以尖角形或多角形為主，排列無規(guī)則，體積較大，核仁大且明顯，胞質內雜志較多。
　　2、MCF-7親本細胞，4-OHT誘導14d、28d各組之間細胞生長速度無明顯變化，增殖能力與MCF-7細胞相似。
　　3、隨著誘導時間的增加，不同濃度的4-OHT作用下的各組細胞的抑制率均逐漸降低，而IC50和RI均逐漸增高。其中，在誘導第14天時，獲得的細胞株MCF-714d的IC50、RI達到

7、最高值，并顯著高于MCF-7細胞株，說明其耐藥性最高。但隨著4-OHT誘導時間分別延長至21天和28天時，獲得的細胞株MCF-721d和MCF-728d的IC50和RI均較MCF-714d細胞降低，其中誘導至28天時，細胞的IC50趨于穩(wěn)定。
　　不同濃度OHT對各組細胞株的抑制率存在差異，其中OHT的濃度為10-4 mol/L時，對各組細胞株的抑制率均最高，而濃度為10-8 mol/L時抑制率最低，并且在濃度為10-8mol/L

8、時，OHT對MCF-728d細胞無抑制作用。
　　4、MCF-728d組的遷移細胞數較另兩組細胞均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義。表明MCF-728d組細胞侵襲遷移能力明顯增強。
　　5、使用OHT誘導MCF-7第7天時，獲得的細胞MCF-77d的GFRα2mRNA和HER2 mRNA表達量較MCF-7細胞低;誘導至第14天時，MCF-714d細胞中兩者表達水平均明顯增高，與親本MCF-7細胞相比顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜

9、0.05)。誘導第21天時，兩者表達水平不再增高，反而下降。28天時，MCF-728d細胞的GFRα2 mRNA表達量仍較MCF-7高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但其HER2 mRNA表達卻較MCF-7明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。使用Western blot檢測MCF-714d細胞的GFRα2和HER2蛋白表達情況，結果顯示， GFRα2及HER2均有明顯條帶顯示，表明細胞中GFRα2和HER2蛋白有表達。

10、>　　結論:采用高濃度短時間OHT他莫昔芬沖擊法誘導乳腺癌細胞株MCF-7，在誘導至第14天時成功構建乳腺癌細胞他莫昔芬耐藥細胞株MCF-714d。與其他誘導時間的乳腺癌細胞株比較，使用CCK8試劑盒檢測結果表明，該耐藥細胞株的耐藥指數最大，耐藥性最強;而RT-PCR檢測結果顯示，該耐藥細胞株中GFRα2 mRNA和HER2 mRNA表達量最高。提示GFRα2 mRNA和HER2 mRNA表達狀況與MCF-7細胞的他莫昔芬耐藥有關，兩者