他莫昔芬對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期蛋白E的影響及其信號(hào)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：在乳腺癌腫瘤細(xì)胞和組織中，可觀察到野生型周期蛋白 E（CCNE）表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨大量低分子量周期蛋白E（LMW-CCNE）的生成。LMW-CCNE表達(dá)水平可預(yù)示乳腺癌患者臨床預(yù)后不良和對(duì)抗雌激素治療。他莫昔芬（TAM）長(zhǎng)時(shí)間用于乳腺癌治療可引起藥物耐受及乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,但其機(jī)制尚未明了。本研究旨在探討4-羥基他莫昔芬(OHT，TAM的活性形式）對(duì)乳腺癌細(xì)胞CCNE蛋白剪切、細(xì)胞遷移的影響及其信號(hào)機(jī)制。
　　方法

2、：采用雌激素受體（ER）陽(yáng)性/G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）陽(yáng)性乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7和ER陰性/GPR30陽(yáng)性細(xì)胞SK-BR-3為模型系統(tǒng)，以ER陰性/GPR30陰性細(xì)胞MDA-MB-231作為對(duì)照。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，以O(shè)HT刺激模型細(xì)胞，通過(guò)蛋白印跡法觀察蛋白質(zhì)分子量變化，細(xì)胞劃痕法觀察細(xì)胞遷移變化；采用GPR30抑制劑G15或表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）抑制劑（EI）預(yù)處理模型細(xì)胞，或siRNA轉(zhuǎn)染沉默靶基因表達(dá)，觀察這些因素對(duì)OH

3、T誘導(dǎo)CCNE蛋白剪切和細(xì)胞遷移的影響。
　　結(jié)果：(1)雌激素（E2）可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞CCNE剪切及細(xì)胞遷移，但OHT不能阻斷E2誘導(dǎo)的上述效應(yīng)，提示E2誘導(dǎo)的效應(yīng)可能為非雌激素受體α（estrogen receptorα）依賴性。(2)采用OHT單獨(dú)處理MCF-7或SK-BR-3細(xì)胞，可觀察到類似于E2引起的CCNE蛋白剪切效應(yīng)，而OHT對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞CCNE無(wú)明顯影響。以不同濃度的OHT（1~20μM）

4、處理培養(yǎng)MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)1μM OHT即可誘導(dǎo)CCNE的蛋白剪切反應(yīng)，呈量效依賴關(guān)系；時(shí)效觀察顯示，OHT在作用1h即可誘導(dǎo)明顯效應(yīng)，可持續(xù)~24 h。結(jié)果提示，OHT誘導(dǎo)的上述效應(yīng)可能與GPR30有關(guān)，其特點(diǎn)為快速而持續(xù)。(3) GPR30特異性抑制劑G15（1μM）或siRNA沉默GPR30表達(dá)可顯著抑制或消除OHT誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞CCNE蛋白剪切；G15明顯抑制OHT誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，提示OHT誘導(dǎo)的MCF-7

5、細(xì)胞反應(yīng)可能是通過(guò) GPR30實(shí)現(xiàn)的。(4) EGF刺激可誘導(dǎo)類似OHT引起的CCNE反應(yīng)，而細(xì)胞外信號(hào)激活蛋白激酶（ERK）磷酸化活化的抑制劑U0126或EGFR的抑制劑均可顯著抑制或消除OHT誘導(dǎo)細(xì)胞CCNE蛋白剪切。
　　結(jié)論:（1）OHT誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞CCNE的蛋白剪切，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞遷移（2）OHT通過(guò) GPR30-EGFR-ERK信號(hào)通路誘導(dǎo) CCNE蛋白剪切和細(xì)胞遷移;（3）GPR30介導(dǎo)的CCNE蛋白剪切和