二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬對(duì)乳腺癌細(xì)胞功能及分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　他莫昔芬是ER+乳腺癌病人內(nèi)分泌治療的金標(biāo)準(zhǔn)，長(zhǎng)期的他莫昔芬治療能引起30％的乳腺癌病人產(chǎn)生耐藥性，并產(chǎn)生如子宮內(nèi)膜增生、血栓形成等副作用。二甲雙胍是一類廣泛用于2型糖尿病治療的一線口服藥物，近年來(lái)meta分析表明二甲雙胍能夠降低乳腺癌的發(fā)病率及死亡率，提高乳腺癌病人的生存期。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)表明二甲雙胍能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，二甲雙胍與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合時(shí)，能增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物作用的敏感性。此外，二

2、甲雙胍還能抑制他莫昔芬引起的副作用。因此，本研究旨在探究二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬對(duì)ER+ MCF-7細(xì)胞及ER-MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)功能的影響并進(jìn)一步探討其所涉及的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定他莫昔芬(0-25μM)、二甲雙胍(0-25mM)單獨(dú)以及聯(lián)合24h、48h、72h對(duì)于MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞的活力的影。
　　2.顯微鏡下觀察他莫昔芬(MCF-7細(xì)胞:12.51

3、μM; MDA-MB-231細(xì)胞:18.75μM)、二甲雙胍(5mM)單獨(dú)及聯(lián)合72h對(duì)于MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的影響。
　　3.采用平板克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定他莫昔芬(MCF-7細(xì)胞:12.5μM; MDA-MB-231細(xì)胞:18.75μM)、二甲雙胍(5mM)單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.利用Annexin V-Fluorescein/PI流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兩藥

4、單獨(dú)及聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞72h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　5.運(yùn)用小管形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定兩類藥物單獨(dú)及聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞72h后對(duì)血管狀類似物形成能力的影響。
　　6.用transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定兩類藥物單獨(dú)及聯(lián)合作用MDA-MB-231細(xì)胞72h后對(duì)細(xì)胞遷移以及侵襲能力的影響。
　　7.用western blotting技術(shù)檢測(cè)兩類藥物單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)于細(xì)胞內(nèi)p

5、-ERK、ERK、p-JNK、JNK、β-actin、c-Myc蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明他莫昔芬對(duì)MCF-7細(xì)胞以及MDA-MB-231細(xì)胞表現(xiàn)出了雙相作用，即低濃度他莫昔芬(MCF-7細(xì)胞:3.125μM、6.25μM，48h;MDA-MB-231細(xì)胞:3.125μM，48h)促進(jìn)細(xì)胞的活力(P＜0.05-0.01)，較高濃度他莫昔芬(MCF-7細(xì)胞:12.5μM、18.75μM、25μM;

6、 MDA-MB-231細(xì)胞:18.75μM、25μM)以時(shí)間濃度依賴的方式抑制細(xì)胞的活力(P＜0.01);二甲雙胍也以濃度和時(shí)間依賴的方式抑制了兩類細(xì)胞的活力(P＜0.01)。他莫昔芬(MCF-7細(xì)胞:12.5μM;MDA-MB-231細(xì)胞:18.75μM)單獨(dú)能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，使細(xì)胞數(shù)目減少，同時(shí)變圓變小的細(xì)胞數(shù)增多，二甲雙胍抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)兩藥物聯(lián)合時(shí)，細(xì)胞數(shù)目減少明顯，變圓變小的細(xì)胞也顯著增加。他莫昔芬(MCF-7細(xì)胞:12.5

7、μM;;MDA-MB-231細(xì)胞:18.75μM)+二甲雙胍(5mM)聯(lián)合組對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞生長(zhǎng)、集落形成、小管形成的抑制作用均強(qiáng)于他莫昔芬、二甲雙胍單獨(dú)組（P＜0.01）。12.5μM(P＜0.01)、18.75μM(P＜0.01)他莫昔芬促進(jìn)MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，5mM的二甲雙胍不誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，兩藥物聯(lián)合對(duì)細(xì)胞的凋亡作用顯著高于他莫昔芬單獨(dú)組(P＜0.01)。在MDA-MB-231細(xì)胞中，他莫昔芬（18.

8、75μM）+二甲雙胍(5mM)聯(lián)合組(P＜0.01)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲能力的抑制作用均高于他莫昔芬(P＜0.01）、二甲雙胍(P＜0.01)單獨(dú)組;二甲雙胍(P＜0.05-0.01)、他莫昔芬(P＜0.05-0.01)單獨(dú)能以濃度依賴的方式抑制兩類細(xì)胞中c-Myc蛋白的表達(dá)，兩藥聯(lián)合對(duì)c-Myc的抑制作用顯著高于兩藥單獨(dú)組(P＜0.01）;兩藥物聯(lián)合相對(duì)于兩藥物單獨(dú)不表現(xiàn)出對(duì)MAPK家族的p-ERK/ERK、p-JNK