外周型苯二氮(艸卓)受體在大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用與機(jī)制探討.pdf

1、目的： 在溶栓、不穩(wěn)定心絞痛、心內(nèi)直視手術(shù)、心肺移植、冠脈搭橋手術(shù)和心肺復(fù)蘇時(shí)，心肌缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，IRI)仍無法完全避免。防治器官IRI仍是臨床亟待解決的重要問題之一。 Murry等于1986年首先報(bào)道在心肌細(xì)胞中存在缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)現(xiàn)象，相繼研究發(fā)現(xiàn)藥物預(yù)適應(yīng)可產(chǎn)生類似于IPC的保護(hù)作用。深入研究表明，線粒

2、體損傷是導(dǎo)致IRI心肌不可逆損傷的重要原因，因而線粒體在IRI器官保護(hù)中的地位越來越受到重視。尤其線粒體膜通透性改變在細(xì)胞凋亡中起重要作用。在線粒體膜通透性調(diào)節(jié)中，線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(permeability transition pore，PTP)起決定性作用。線粒體參與細(xì)胞凋亡的早期過程是線粒體PTP開放，使線粒體內(nèi)外H+梯度消失、呼吸鏈脫偶聯(lián)、能量產(chǎn)生中斷、基質(zhì)腫脹并導(dǎo)致外膜破裂，釋放出細(xì)胞色素C等各種活性蛋白。從而進(jìn)一步激活ca

3、spase級聯(lián)瀑布式反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 外周型苯二氮革類受體(peripheral benzodiazepine receptor，PBR)是一種線粒體外膜蛋白，與電壓依賴性陰離子通道(voltage—dependent anion channel，VDAC)和核苷酸腺嘌呤轉(zhuǎn)位體(adenine nucleotide translocator，ANT)共同組成線粒體PTP。PBR廣泛存在于心臟、肺臟、肝臟、腎臟及血液細(xì)胞中，并

4、參與調(diào)節(jié)線粒體PTP的開放。因此，確定PBR及其配體在線粒體、細(xì)胞和心肌再灌注損傷中的作用具有重要的意義。 本研究擬在建立體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型的基礎(chǔ)上，測定PBR基因表達(dá)的變化及其對細(xì)胞凋亡的影響。并觀察PBR對缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，蛋白激酶C表達(dá)及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl2/Bax、Caspase—3等蛋白表達(dá)的影響，旨在闡明PBR參與調(diào)控細(xì)胞缺血缺氧性損傷的機(jī)制。并進(jìn)一步選用目前臨床常用的苯二氮()類靜脈麻

5、醉藥咪達(dá)唑侖，觀察其對缺氧復(fù)氧損傷所致細(xì)胞凋亡和相關(guān)因子表達(dá)的影響，及其與PBR的關(guān)系，為臨床麻醉藥物選擇提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～4d齡的Wister大鼠，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 2、實(shí)驗(yàn)試劑 PK11195(Alexis，美國)；Ro5—4864(Biomol，美國)；咪達(dá)唑侖(上海羅氏大藥廠)；Bcl—2/Bax兔抗鼠多克隆抗體(即用型)(Santa，美國)；

6、Caspase—3、PKC—Epsilon兔抗鼠多克隆抗體(Neomarker，美國)；Histostain TM Plus Kits SP9000免疫組化染色試劑盒、ZLI—9108濃縮型DAB試劑盒(北京中杉生物公司)；Furo—2/AM、碘化丙啶(Sigma，美國)；胰蛋白酶(1：250)(Amresco，美國)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；極品胎牛血清(天津?yàn)笊?；FITC—Annexin V(寶靈曼，德國)；Tri

7、zol(Invitrogen，美國)；One step RT-PCR試劑盒(Promega，美國)；聚偏二氟乙烯(PVDF)蛋白印跡膜(Bio—Rad，美國)；PBS等其它試劑為國產(chǎn)分析純。 3、主要實(shí)驗(yàn)儀器 (1)振蕩水浴箱(GFL THERMOLAB，美國) (2)超低溫冰箱(SANYO MDF—U，日本) (3)旋渦振蕩器(VORTEX—2 GENE，美國) (4)水平板電泳系統(tǒng)(BIO—R

8、AD Sub—cell GT，美國) (5)通用電泳儀(BIO—RAD PowerPac200，美國) (6)臺式低溫高速冷凍離心機(jī)(Sigma3K30，美國) (7)二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(KENDRO/HERAEUS，德國) (8)細(xì)胞培養(yǎng)專用超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國) (9)倒置顯微鏡(OLYMPUS AX70，日本) (10)水平搖床(GFL，美國) (11)

9、顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus AX70/Coolsnapx/MetaMorph，日本) (12)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(余姚TDW，中國) (13)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀(Alphainnotech ChemiImager5500，美國) (14)小型垂直電泳儀(Bio—Rad Mini-ProteinⅢ，美國) (15)半干轉(zhuǎn)印儀(Bio—Rad Seimidry transfer system，美國)

10、 (16)自動(dòng)封膜儀(江蘇儀器設(shè)備公司，中國) (17) HEIDOLPH DIAX900型勻漿機(jī)(德國) (18) PTC—100型PCR擴(kuò)增儀(美國) (19) FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD，美國) (20) GLS—700D型數(shù)碼凝膠掃描分析系統(tǒng)(上海，中國) (21)A—200 Ds電子天平(美國) (22)B—Brown微量泵(德國) (23)超純水裝

11、置(MILLIPORE MILLI—Q，美國) (24)實(shí)驗(yàn)室制冰機(jī)(ZIGERA2BE—70-35，德國) (25)恒溫振蕩培養(yǎng)箱(GFL，德國) (26)小型臺式離心機(jī)(SIGMA1—13，美國) (27) PH計(jì)(WTW InoLab，德國) (28)電動(dòng)高壓消毒鍋(HIRAYAMA HVE—50，美國) (29) HSS—1數(shù)字超級恒溫浴槽(成都儀器廠，中國) (30)倒置

12、相差顯微鏡(OLYMPUS，日本) (31)培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、離心管等(Cornling，美國) 實(shí)驗(yàn)方法： 1、心肌細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 2～4d齡的Wister大鼠，雌雄不拘，采用改良的Simpson法分離心肌細(xì)胞，膠原酶和胰蛋白酶分次消化，收集細(xì)胞，利用貼壁速度的差異去除貼壁的非心肌細(xì)胞。細(xì)胞接近融合呈整體搏動(dòng)，開始實(shí)驗(yàn)。 心肌細(xì)胞成活檢查和鑒定：采用0.4％胎盤蘭染色，不著色者為存活細(xì)胞。

13、倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)4～5d后可形成細(xì)胞簇，并出現(xiàn)同簇細(xì)胞的同步搏動(dòng)。電鏡下觀察可見心肌細(xì)胞肌節(jié)清楚，確認(rèn)心肌細(xì)胞培養(yǎng)成功。 2、建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型 培養(yǎng)至融合狀態(tài)的細(xì)胞先用99.9％高純氮?dú)怙柡?5min的低糖DMEM培養(yǎng)液換液，置于缺氧復(fù)氧裝置中，充人99.99％高純氮?dú)庵脫Q裝置內(nèi)空氣造成缺氧，氣體通過濾過裝置除去細(xì)菌等微生物，調(diào)節(jié)氣體流量計(jì)使氣體流速為5L/min，5min后關(guān)閉進(jìn)出氣閥門，放

14、入5％ CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)30min。復(fù)氧時(shí)迅速打開裝置，用含20％胎牛血清的高糖DMEM營養(yǎng)液換液后置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)2h，建立缺氧復(fù)氧損傷模型。 3、實(shí)驗(yàn)分組和取材 將培養(yǎng)至融合狀態(tài)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為七組，即C組(空白對照組)、HR組(缺氧30min復(fù)氧2h組)、P組(PK11195組)、R組(Ro5—4864組)、M組(咪達(dá)唑侖組)、PR組(PK11195+Ro5—4864組)和PM組(PK11195+咪達(dá)唑

15、侖組)，P、R、M組在缺氧前30min于培養(yǎng)液中分別加入終濃度10-4mol/L PK11195、Ro5—4864和咪達(dá)唑侖；PR組和PM組在缺氧前30min加入以上濃度的兩種藥物共同孵育，然后再進(jìn)行缺氧復(fù)氧。模型建立成功后，培養(yǎng)皿內(nèi)爬片細(xì)胞以4％多聚甲醛固定，—4℃冰箱保存，用于免疫組化染色，另一部分活細(xì)胞直接進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣測定。培養(yǎng)瓶內(nèi)的融合細(xì)胞，收集于凍存管，液氮速凍后—70℃保存，用于RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)。

16、 4、檢測指標(biāo) (1) RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞PBR mRNA表達(dá) (2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色測定Caspase—3蛋白表達(dá) (3)免疫蛋白印跡雜交(Western blot)測定Bcl—2、Bax和PKC蛋白的表達(dá) (4)流式細(xì)胞儀FITC—Annexin V/PI法檢測細(xì)胞凋亡 (5)Meta Flour單細(xì)胞內(nèi)鈣測定系統(tǒng)測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采

17、用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)，P<0.05差異具有顯著性。 結(jié)論： 1、PBR參與調(diào)節(jié)缺氧復(fù)氧損傷所致的心肌細(xì)胞凋亡。PBR基因表達(dá)的變化與細(xì)胞凋亡程度相反，表現(xiàn)出抗凋亡因子的特征。 2、PBR抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷所致的細(xì)胞凋亡的與抑制Caspase—3活化，上調(diào)Bcl—2和下調(diào)Bax表達(dá)，以及活化PK