PUMA介導(dǎo)缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、凋亡引起的心肌細(xì)胞損失是缺血/再灌注損傷(ischemia/perfusion injury,IRI)的重要病理特征。闡明對心肌IRI中心肌細(xì)胞凋亡起關(guān)鍵性作用的蛋白質(zhì)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,對揭示心肌IRI的本質(zhì)尋找并確立藥物靶點(diǎn),有效防治心肌IRI具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 p53上調(diào)凋亡調(diào)制物(p53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA)是近年發(fā)現(xiàn)促凋亡作用最強(qiáng)的BH3-only蛋白質(zhì)

2、家族成員之一,是Bax/Bak上游的主要促凋亡蛋白質(zhì),能隔離所有的Bcl-2抗凋亡蛋白質(zhì)作用。PUMA在多種病理性因素的刺激下通過p53依賴和非依賴途徑激活介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在凋亡通路上發(fā)揮著舉足輕重的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用原代大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型模擬在體心肌IRI,探討促凋亡蛋白PUMA是否介導(dǎo)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生?遏制PUMA表達(dá)是否可以下調(diào)心肌細(xì)胞凋亡而達(dá)到

3、減輕H/R損傷的作用?
　　 第一部分、PUMA在大鼠心肌細(xì)胞H/R損傷中的作用及意義
　　 目的:
　　 應(yīng)用乳鼠原代心肌細(xì)胞H/R損傷模型,探討PUMA在大鼠心肌細(xì)胞H/R損傷中的作用及意義。
　　 方法：
　　 原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞被隨機(jī)分為5組,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。①正常對照(control)組；②H/R2h組；③H/R4h組；④H/R6h組；⑤H/R12h組。采用生化自動(dòng)分析儀測定LDH活性、M

4、TT法測定細(xì)胞存活率、Annexin V-FITC和PI聯(lián)合染色的流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率、RT-PCR和Western blot方法檢測PUMA及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的mRNA及蛋白的表達(dá)變化及分光光度法檢測Caspase3活性變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡
　　 H/R處理后心肌細(xì)胞凋亡率迅速上升,其中以H/R6h最為明顯,細(xì)胞凋亡率(23.44±4.16)％顯著高于Contro

5、l組(3.12±0.46)％(P<0.05)；H/R12h Caspase3活性達(dá)峰值為Control組的(4.57±0.48)倍(P<0.05)。
　　 2、H/R誘導(dǎo)PUMA及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)變化RT-PCR圖像分析顯示:PUMA mRNA H/R2h開始升高(0.45±0.05),6h達(dá)峰值(0.76±0.06),持續(xù)到12h(0.71±0.07)仍高于Control組(0.29±0.02)(P<0.05

6、)；Bax mRNA在H/R2h開始升高(0.63±0.07),6h達(dá)峰值(0.96±0.09),持續(xù)到12h(0.790.09)仍高于Control組(0.28±0.05)(P<0.05)；與Control組(0.974±0.08)相比,Bcl-2 mRNA H/R2h開始下降(0.82±0.07),12h降至最低(0.47±0.05)(P<0.05)。
　　 Western Blot圖像分析顯示:Control組中PUMA蛋

7、白的表達(dá)量很低(0.08±0.01),H/R4h出現(xiàn)明顯上調(diào)(0.33±0.04),6h顯著升高(0.68±0.07),12h達(dá)峰值(0.72±0.07)(P<0.05)；與Control組(0.28±0.04)相比,Bax蛋白H/R2h開始升高(0.49±0.05),6h顯著升高(0.92±0.08),12h達(dá)峰值(0.97±0.10)(P<0.05)；與Control組(0.68±0.07)相比,Bcl-2蛋白H/R2h開始降低(0

8、.56±0.06),12h降至最低(0.26±0.02)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。PUMA在正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中表達(dá)很低,心肌細(xì)胞H/R后迅速上調(diào),其表達(dá)變化與心肌細(xì)胞凋亡率、Caspase3活性變化及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)變化正相關(guān),與Bcl-2表達(dá)變化負(fù)相關(guān),提示促凋亡蛋白PUMA可能通過上調(diào)Bax表達(dá)及下調(diào)Bcl-2表達(dá),導(dǎo)致Caspase3活性增加介導(dǎo)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

9、。
　　 目的:
　　 應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將PUMA特異性siRNA(si－PUMA)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,探討si－PUMA對心肌細(xì)胞H/R損傷的影響。
　　 方法：
　　 原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞被隨機(jī)分為4組,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。①正常對照(control)組；②H/R6h組；③轉(zhuǎn)染錯(cuò)義siRNA+H/R6h組(si-SCR)；④轉(zhuǎn)染si-PUMA+H/R6h組(si-PUMA)。siRNA干擾心肌細(xì)胞PUMA表達(dá)3

10、6 h后,制備心肌細(xì)胞H/R損傷模型,在H/R6h即PUMA表達(dá)最顯著時(shí)間點(diǎn),觀察下調(diào)PUMA表達(dá)對心肌細(xì)胞H/R損傷的作用。觀察指標(biāo)和方法同前。
　　 結(jié)果：
　　 1、si-PUMA特異性下調(diào)心肌細(xì)胞PUMA表達(dá)。si-PUMA組PUMA mRNA(0.10±0.002)顯著低于H/R6h組(1.06+0.08)(P<0.05)；si-PUMA組PUMA蛋白(0.33±0.04)顯著低于H/R6h組(0.84±0.0

11、9)(P<0.05)。
　　 2、與H/R6h組(60.7±6.84)％相比,si－PUMA組細(xì)胞存活率(75.3±4.29)％明顯上調(diào)(P<0.05)；與H/R6h組(1237±107)U/L相比,si－PUMA組LDH活性(802±55)U/L顯著降低(P<0.05)；與H/R6h組(23.96±5.02)％相比,si－PUMA組細(xì)胞凋亡率(14.16±4.02)％明顯下降(P<0.05)。
　　 3、與H/R6h組

12、(1.06±0.07)相比,si－PUMA組Bax蛋白(0.64±0.05)表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與H/R6h組(0.52±0.06)相比,si-PUMA組Bcl-2蛋白(0.68±0.08)表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與H/R6h組(4.62±0.34)相比,si-PUMA組Caspase3活性(2.97±0.25)活性下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 化學(xué)合成的si-PUMA可以通過脂質(zhì)體方法高效轉(zhuǎn)染心肌

13、細(xì)胞。特異性干擾PUMA表達(dá)后,心肌細(xì)胞存活率升高、LDH溢出減少,凋亡率明顯下調(diào),其主要機(jī)制可能是si-PUMA干擾PUMA的促凋亡作用,導(dǎo)致Bax表達(dá)下調(diào)和Bcl-2表達(dá)上調(diào)而使Caspase-3的活化程度降低,造成心肌細(xì)胞凋亡率下降。提示si-PUMA對心肌細(xì)胞H/R損傷具有較好的保護(hù)作用。
　　 本文結(jié)論:
　　 1、促凋亡蛋白PUMA介導(dǎo)了H/R心肌細(xì)胞損傷,是H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子。