胡黃連苷Ⅱ?qū)θ毖?復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　 心肌缺血再灌注損傷(myocardialischemia-reperfusioninjury,MIRI)是指心肌缺血后一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供,不僅未能完全改善心臟功能,反而加重原有的缺血性心肌損傷,出現(xiàn)心律失常、心肌梗死面積增大、心臟衰竭等更嚴(yán)重的損傷。隨著心臟移植、冠狀動(dòng)脈搭橋以及經(jīng)皮冠脈介入等治療手段廣泛地應(yīng)用于臨床,心肌缺血再灌注損傷已成為臨床上常見(jiàn)的一種病理生理現(xiàn)象。心肌缺血及缺血再灌注中均伴有心肌細(xì)胞的凋亡,

2、從而對(duì)心臟的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的影響。因此,探索有效的藥物防治心肌缺血再灌注損傷、抑制心肌細(xì)胞凋亡,改善心臟功能有重要的臨床意義。
　　 胡黃連苷Ⅱ(picrosideⅡ)從玄參科植物西藏胡黃連的根莖提取的環(huán)烯醚萜苷類化合物。在神經(jīng)細(xì)胞及其他細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)它具有抗凋亡的作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胡黃連苷Ⅱ能抑制H2O2誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞損傷及凋亡,激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)生長(zhǎng)。胡黃連苷Ⅱ?qū)π难苎趸瘧?yīng)激的作用還未有報(bào)道,但有研究表明

3、胡黃連苷Ⅱ能抑制腦缺血再灌注動(dòng)物模型中的氧化應(yīng)激,在外周組織如腎臟中,胡黃連苷Ⅱ也具有保護(hù)作用。因此,我們很有理由去研究胡黃連苷Ⅱ是否也能對(duì)抗心血管疾病中的氧化應(yīng)激損傷。
　　 PI3K-Akt信號(hào)通路是重要的促細(xì)胞存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路能夠抑制多種刺激所致的細(xì)胞凋亡,維持細(xì)胞存活。多種生長(zhǎng)因子均可通過(guò)PI3K途徑激活A(yù)kt/PKB。完全活化的Akt通過(guò)磷酸化和鈍化其下游底物,經(jīng)由多種途徑而促進(jìn)細(xì)胞的存活。Akt介導(dǎo)的Bcl-

4、2上調(diào)對(duì)于心肌細(xì)胞的存活也具有重要作用。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)是Akt的下游信號(hào)分子,CREB被Akt磷酸化后成為活性CREB(即p-CREB),p-CREB又可促進(jìn)下游分子Bcl-2的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活。根據(jù)功能可將Bcl-2基因家族分為兩類:一類是抗凋亡的,如Bcl-2、Bcl-XL;一類是促凋亡的,如Bax、Bad等。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),位于線粒體外膜的Bcl-2家族蛋白,能通過(guò)改變線粒體細(xì)胞膜的通透性,誘導(dǎo)

5、細(xì)胞凋亡。
　　 為此本實(shí)驗(yàn)擬采用SD乳鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,建立H/R模型。觀察了在離體細(xì)胞給予胡黃連苷Ⅱ治療是否可以減輕缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡以及分析了胡黃連苷Ⅱ抗心肌細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,尤其是胡黃連苷Ⅱ的這種保護(hù)作用是否是部分通過(guò)激活傳導(dǎo)通路PI3K/Akt-CREB,調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
　　 材料與方法：
　　 1.以原代培養(yǎng)的SD(Spmgue-Dawley)乳鼠心肌細(xì)胞

6、作為研究對(duì)象,并通過(guò)缺氧3h復(fù)氧2h建立缺氧/復(fù)氧模型。設(shè)立正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組(H/R)、胡黃連苷Ⅱ(50、100、200μg/ml)預(yù)處理組(H/R+50、100、200μg/mlpicrosideⅡ)、wortmannin+胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理組(H/R+pierosideⅡ+wortmannin組)及LY294002+胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理組(H/R+picrosideⅡ+LY294002組)。濃度根據(jù)已有文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。
　

7、　 2.原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,胡黃連苷Ⅱ和/或H/R共同處理,收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液:分別加入PI3K的特異性抑制劑wortmannin及LY294002進(jìn)行干預(yù),收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液,用于指標(biāo)檢測(cè)。
　　 3.采用四唑鹽(MTT)法檢測(cè)胡黃連苷Ⅱ?qū)υ囵B(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響。
　　 4.應(yīng)用乳酸脫氫酶(LDH),超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞LDH,SOD,MDA的活性。
　　

8、 5.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的濃度。
　　 6.應(yīng)用及AnnexinV-FITC/PI和hoechst33258試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。
　　 7.采用底物酶解熒光法檢測(cè)caspase-3活性,反映心肌細(xì)胞的凋亡程度。
　　 8.采用westernblotting法檢測(cè)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞Akt、p-Akt、CREB、p-CREB、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。
　　 9.各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均

9、用-x±s表示,利用spss11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.培養(yǎng)3天的心肌細(xì)胞在實(shí)施缺氧期3h后,LDH和MDA均較缺氧前有所升高,SOD降低(P＜0.01);而給予復(fù)氧期2h后,LDH和MDA明顯高于缺氧期,而SOD進(jìn)一步降低(P＜0.01),對(duì)照組的上述指標(biāo)在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)。
　　 2.200μg/mlpicr

10、osideⅡ處理0h、24h、48h、72h,較對(duì)照組細(xì)胞存活率明顯升高。PicrosideⅡ作用48h時(shí),心肌細(xì)胞存活率達(dá)峰值(92.3±3.02%)。
　　 3.不同濃度50、100、200μg/mlpicrosideⅡ預(yù)處理可以減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,隨著picrosideⅡ濃度的增加,相應(yīng)的MTT檢測(cè)的OD值也隨之增加分別為74.17±3.51,83±4.5%and92.02±3.6%。
　　 4.H/R組在H

11、/R處理后心肌細(xì)胞受到損傷,LDH較C組明顯增高,損傷后MDA亦較C組明顯增高,SOD較C組明顯降低(均P＜0.05)。PicrosideⅡ(50,100,and200μg/m1)預(yù)處理H/R損傷細(xì)胞,均較H/R組細(xì)胞損傷小,LDH和MDA含量明顯減少,而SOD則較H/R組明顯增加。
　　 5.經(jīng)H/R處理后,細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),用不同的濃度picrosidcⅡ(50,100,or200μg/mL)預(yù)處理48h后,與H/R組

12、相比細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯下降為,呈濃度依賴性(140.21±9.11,120.03±8.05and98.12±7.31,respectively)(allPallP＜0.01vsH/R)。##6.AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率顯示C組細(xì)胞的存活率為3.3±0.95%:而H/R組細(xì)胞的凋亡率顯著升高,凋亡率為27.09±3.42%,說(shuō)明H/R誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的凋亡。用不同濃度的picrosideⅡ(200μg/mL)預(yù)處理

13、細(xì)胞后再施以H/R,細(xì)胞的凋亡率降低至9.05±2.0%(P＜0.01).然而,wortmannin或LY294002預(yù)處理能夠阻斷picrosideⅡ保護(hù)作用(23.01±2.80%and21.02±3.10,respectively)(allPallP＜0.01)。
　　 7.正常的心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,染色均勻,呈正常的藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核有明顯的染色質(zhì)邊聚呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染,變形亮度增強(qiáng),顏色發(fā)白。H

14、oechst33258結(jié)果顯示:C組細(xì)胞少見(jiàn)白色亮點(diǎn),picrosideⅡ組細(xì)胞見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞。經(jīng)picrosideⅡ(200μg/ml)處理后,白色亮點(diǎn)呈明顯減少,凋亡細(xì)胞明顯減低。然而,wortmannin或LY294002預(yù)處理能夠阻斷picrosideⅡ保護(hù)作用。
　　 8.Westernblotting結(jié)果顯示:經(jīng)H/R處理后,Akt、CREB在各組中都有表達(dá),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),p-Akt,p-CREB

15、,Bcl-2蛋白表達(dá)量較C組明顯減少,Bax蛋白表達(dá)較C組明顯增加,差異具有顯著性(P＜0.01)。PicrosideⅡ(50,100,or200μg/mL)可以劑量依賴性地增加p-Akt,p-CREB,Bcl-2蛋白表達(dá),降低Bax蛋白的表達(dá),與H/R組比較差均有顯著性(P＜0.01)。Wortmannin或LY294002預(yù)處理可拮抗picrosideⅡ部分保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過(guò)給新生大鼠體外培養(yǎng)心

16、肌細(xì)胞行缺氧3h/復(fù)氧2h后,可明顯造成心肌細(xì)胞損傷,以此模擬大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　 2.PicrosideⅡ?qū)π募〖?xì)胞存活率的影響具有時(shí)間和劑量依賴性。
　　 3.PicrosideⅡ通過(guò)降低LDH,MDA,增加SOD減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。
　　 4.PicrosideⅡ可能通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS來(lái)參與H/R誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)。
　　 5.PI3/Akt-CREB途徑可能為picrosi