膽管癌表遺傳學研究——去甲基化修飾對RASSF1A基因的表達調(diào)控及對人膽管癌細胞的生物學效應.pdf

1、表遺傳學是指基于非基因序列改變所導致的基因表達水平變化，它決定了基因轉(zhuǎn)錄的開關及其表達方式。當人類進入后基因組時代后，尤其是人類表觀基因組計劃的提出和實施，表遺傳學引起了越來越多的學者關注，并逐漸成為闡明基因組功能的關鍵研究領域之一。DNA甲基化是表遺傳學的主要內(nèi)容之一，也是基因表達重要的調(diào)控方式之一，它可通過基因啟動子及其附近區(qū)域內(nèi)CpG島胞嘧啶的甲基化關閉某種組織或細胞不必需的基因，使之不表達或沉寂。DNMTs是催化和維持DNA甲基

2、化的關鍵酶，在DNA甲基化中起著十分重要的作用。 腫瘤形成是一個多因素、多基因和多途徑的病理過程，其發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關。許多研究表明，抑癌基因的失活與啟動子區(qū)域高甲基化有密切關系，而DNMTs的表達水平升高和活性增加被認為是引起抑癌基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化的主要原因之一。 在鄒聲泉教授的領導下，我們課題組在前期研究中應用DNMTs抑制劑5-Aza-CdR對人膽管癌細胞的生長周期進行觀察，發(fā)現(xiàn)5-Az

3、a-CdR可以在體內(nèi)外抑制膽管癌細胞的增殖，促進細胞凋亡，說明DNMTs在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，也提示我們通過干預DNMTs的表達從而調(diào)控腫瘤相關基因的甲基化狀態(tài)和治療膽管癌具有潛在的意義。同時還發(fā)現(xiàn)，抑癌基因RASSF1A在肝外膽管癌組織中的轉(zhuǎn)錄表達缺失高達68.75％，明顯高于其在癌旁組織中的表達缺失率，并與肝外膽管癌的淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期相關；通過甲基化特異性PCR和DNA測序證實了啟動子區(qū)域CpG島高甲基化是RAS

4、SF1A基因表達缺失的主要機制之一。 為了進一步探討DNA甲基化與基因表達和腫瘤形成之間的關系，我們以催化DNA甲基化發(fā)生的兩個甲基轉(zhuǎn)移酶—DNMT1、DNMT3b和抑癌基因RASSF1A為研究靶標，通過反義RNA技術(shù)下調(diào)DNMT1和DNMT3b在人膽管癌細胞中的表達，初步研究DNMT1和DNMT3b在調(diào)控RASSF1A啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)及其表達的機制，同時觀察下調(diào)DNMT1和DNMT3b的表達對人膽管癌細胞生長的生物學效應，

5、為膽管癌的表遺傳學發(fā)生機制和基因治療提供新的理論基礎和實驗依據(jù)。 第一部分：DNMT1、DNMT3b基因在人膽管癌中的表達及意義 論文1：DNMT1和DNMT3b基因在人膽管癌組織和細胞中的表達及意義 目的研究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNMT3b)在人膽管癌組織和人膽管癌細胞系QBC939中的表達情況，并分析DNMT1和DNMT3b的表達率與膽管癌臨床病理因素之間的關系，探討二者在

6、膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。 結(jié)論 1.在膽管癌組織中，DNMT1和DNMT3b蛋白的表達較膽管炎組織明顯增加，并與腫瘤組織分化程度有關，與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期無明顯關系，說明DNMT1和DNMT3b的高表達可能與膽管癌的發(fā)生發(fā)展有關，且可能是膽管癌發(fā)生中的一個早期分子事件。 2.DNMT1和DNMT3b在人膽管癌細胞系QBC939中存在表達。 第二部分：反義DNMT1

7、和反義DNMT3b基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 論文2：反義DNMT1基因真核表達質(zhì)粒的鑒定 目的鑒定所獲反義DNMT1基因真核表達質(zhì)粒的正確性，為研究DNMT1基因功能提供工具和依據(jù)。 論文3：反義DNMT3b基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 目的構(gòu)建反義DNMT3b基因真核表達質(zhì)粒，為研究DNMT1基因功能提供工具。 結(jié)論通過基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了反義DNMT3b基因真核表達質(zhì)粒，為進一步研究D

8、NMT3b基因功能提供了實驗工具。 第三部分：反義DNMT1和反義DNMT3b基因轉(zhuǎn)染對人膽管癌細胞中RASSF1A基因的表達調(diào)控及其生物學效應 論文4：DNMT1、DNMT3b基因共下調(diào)誘導人膽管癌細胞中RASSF1A基因啟動子區(qū)域去甲基化及其重新表達 目的觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染反義DNMT1、DNMT3b基因真核表達質(zhì)粒對人膽管癌細胞系QBC939中RASSF1A基因啟動子區(qū)域甲基化和該基因表達的影響，初步探討DNMT

9、1、DNMT3b基因在DNA甲基化和基因表達調(diào)控中的作用。 結(jié)論 1.轉(zhuǎn)染反義DNMT1、DNMT3b基因真核表達質(zhì)粒能使人膽管癌細胞系QBC939中DNMT1、DNMT3b蛋白表達水平降低 2.同時下調(diào)DNMT1和DNMT3b在QBC939細胞中的表達或單獨下調(diào)DNMT1的表達，能使RASSF1A基因啟動子區(qū)域去甲基化和誘導其重新表達，其中以前者效果顯著。單獨下調(diào)DNMT3b的表達對RASSF1A基因啟動子區(qū)域

10、甲基化狀態(tài)及其表達沒有影響。 3.在DNA甲基化和相關基因的表達調(diào)控中，DNMT1起著主要作用，DNMT3b扮演著協(xié)同角色，但二者存在效應依賴關系，將其聯(lián)合作用可發(fā)揮1+1＞2的增效效應。 論文5：DNMT1、DNMT3b基因共下調(diào)對人膽管癌細胞的生物學效應 目的觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染反義DNMT1、DNMT3b基因真核表達質(zhì)粒對人膽管癌細胞系QBC939體內(nèi)外生長和增殖能力的影響，初步探討DNMT1、DNMT3b基因在膽

11、管癌發(fā)生中的作用。 結(jié)論 1.通過聯(lián)合轉(zhuǎn)染反義DNMT1和DNMT3b基因真核表達質(zhì)粒，可同時下調(diào)DNMT1和DNMT3b在QBC939細胞中的表達，并能在體內(nèi)外抑制QBC939細胞生長，促進凋亡發(fā)生，其效果明顯優(yōu)于單獨轉(zhuǎn)染反義DNMT1基因。 2.在DNA甲基化的過程中，DNMT1起著主要作用，DNMT3b扮演著協(xié)同角色，二者存在效應依賴關系，將其聯(lián)合作用可發(fā)揮1+1＞2的增效效應，并可能通過甲基化途徑與膽管癌