miRNA let-7a在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)及其對(duì)膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、miRNA let-7a在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)及其對(duì)膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究背景與目的：
　　肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌是起源于肝內(nèi)膽管二級(jí)分支以上的一種原發(fā)于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，或稱為肝內(nèi)型膽管癌。根據(jù)包括美國(guó)、歐洲和日本在內(nèi)的多國(guó)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，目前在肝臟原發(fā)性腫瘤中，其發(fā)病率已僅次于肝細(xì)胞性肝癌，約占10％～15%。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的特點(diǎn)是起病隱匿、發(fā)展迅速、惡

2、性程度高，且由于缺乏理想的早期診斷標(biāo)志物，確診時(shí)已多屬中、晚期，因此手術(shù)切除率低。盡管多年來不斷研究和探索肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，也取得了一些診治方面的進(jìn)展，但總體來說其預(yù)后仍然較差，因此加強(qiáng)對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞分子生物學(xué)特性的研究和探索新的治療方式對(duì)改善膽管癌患者的預(yù)后具有重要意義。
　　微小RNA（miRNA）是一組內(nèi)源性的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸，在進(jìn)化中高度保守，其通過與mRNA3`非

3、編碼區(qū)（3`UTRs）的結(jié)合調(diào)控特異靶基因的表達(dá)，從而在細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡等人體生理過程中起重要作用。通過疾病的miRNA表達(dá)譜與正常表達(dá)譜之間的對(duì)比，研究證實(shí)miRNA通過多種機(jī)制參與人類重大疾病(如惡性腫瘤、艾滋病、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等)的發(fā)生、發(fā)展。目前對(duì)miRNA的研究已經(jīng)成為國(guó)際上腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)。通過眾多的研究發(fā)現(xiàn)，在人類惡性腫瘤中miRNA兼有“癌基因”和“抑癌基因”的雙重作用；其既可作為癌基因，下調(diào)

4、抑癌基因的表達(dá)，也可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性。miRNA突變、缺失或表達(dá)水平的異常都對(duì)人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。Lethal-7（let-7）是人類發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)miRNA，在人類基因組中存在9個(gè)由let-7同源基因家族編碼的miRNA分子，根據(jù)既往對(duì)肺癌、乳腺癌、肝癌和結(jié)腸癌等多種人類惡性腫瘤的研究報(bào)道，它能調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖時(shí)序進(jìn)而在惡性腫瘤組織中起到抑癌基因的作用，同時(shí)也是一種潛在的早期癌癥診斷標(biāo)志物和疾病預(yù)后指標(biāo)。

5、
　　目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于let-7a與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的研究報(bào)道較少，其在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Real-time PCR）檢測(cè)let-7a在肝內(nèi)膽管癌手術(shù)切除標(biāo)本和正常膽管組織中的表達(dá)，同時(shí)采用化學(xué)合成的具有增強(qiáng)內(nèi)源性 miRNA功能的雙鏈RNA（miRNA mimics）和具有抑制特異 miRNA功能的單鏈 RNA（miRNA inhibitor）轉(zhuǎn)染人肝內(nèi)膽管癌HuCCT

6、-1細(xì)胞株，觀察增強(qiáng)和抑制內(nèi)源性let-7a對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖、凋亡和克隆形成率的影響，探討其在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的作用和為探索新的治療方法提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集湖南省人民醫(yī)院2012年3月至10月間16例手術(shù)切除肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌標(biāo)本和9例正常膽管組織標(biāo)本，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)所有標(biāo)本中l(wèi)et-7a的表達(dá)，分析正常膽管組織和膽管癌組織中l(wèi)et-7a表達(dá)的差異,并探討let-7a的表達(dá)量與肝

7、內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　2.培養(yǎng)人肝內(nèi)膽管癌 HuCCT-1細(xì)胞株，體外化學(xué)方法合成 let-7a mimics、let-7a inhibitor和各自陰性對(duì)照，通過Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染入人肝內(nèi)膽管癌HuCCT-1細(xì)胞，設(shè)立未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照組，其余轉(zhuǎn)染細(xì)胞為 let-7a過表達(dá)組、let-7a抑制組、過表達(dá)陰性對(duì)照組和抑制陰性對(duì)照組，采用熒光顯微鏡直接觀察評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果，于細(xì)胞轉(zhuǎn)

8、染后的第24和48小時(shí)以Real-time PCR方法分別檢測(cè)五組細(xì)胞內(nèi)let-7a表達(dá)量的差異，評(píng)價(jià)干擾效果。
　　3.通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK8）、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以及克隆形成實(shí)驗(yàn)來觀察增強(qiáng)和抑制let-7a對(duì)膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果：
　　1.let-7a在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)量為（0.36±0.21），而其在正常膽管組織中的表達(dá)量為（9.53±4.06），其差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0

9、.00）；let-7a的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）和組織學(xué)分化程度（P=0.00）有關(guān)，與患者性別、年齡、門靜脈浸潤(rùn)、腫瘤大小之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.let-7a mimics、inhibitor和各自陰性對(duì)照能被高效轉(zhuǎn)染入人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HuCCT-1。通過let-7a mimics轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞株HuCCT-1可顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)let-7a的表達(dá)（P=0.00），通過let-7a inhibito

10、r轉(zhuǎn)染HuCCT-1細(xì)胞株可有效抑制細(xì)胞內(nèi)let-7a的表達(dá)量（P=0.00），轉(zhuǎn)染各自陰性對(duì)照試劑的對(duì)照組細(xì)胞和HuCCT-1細(xì)胞自然生長(zhǎng)的空白對(duì)照組之間，let-7a的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.CCK8實(shí)驗(yàn)中增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)let-7a表達(dá)可抑制膽管癌細(xì)胞HuCCT-1的增殖（P=0.00），而抑制let-7a的表達(dá)可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞HuCCT-1的增殖（P=0.00），過表達(dá)陰性對(duì)照組、抑制陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組

11、之間細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；上調(diào)let-7a的表達(dá)可明顯促進(jìn)HuCCT-1細(xì)胞的凋亡（P=0.00），抑制let-7a的表達(dá)則可明顯抑制HuCCT-1細(xì)胞的凋亡率（P=0.00），兩組陰性對(duì)照和空白對(duì)照組細(xì)胞之間凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；過表達(dá)let-7a的膽管癌HuCCT-1細(xì)胞其克隆形成率明顯降低（P<0.05）而抑制let-7a表達(dá)的HuCCT-1細(xì)胞其克隆形成率明顯升高（P<0.05），空白對(duì)照

12、組和過表達(dá)陰性對(duì)照組、抑制陰性對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.let-7a在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，let-7a的下調(diào)可能在肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用。
　　2.Let-7a的低表達(dá)提示患者存在較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和較低的組織學(xué)分化程度。
　　3.let-7a mimics可以明顯增強(qiáng)人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HuCCT-1中l(wèi)et-7a的表達(dá)，let-7a inhibit