膽管癌中Bcl-2表達意義及Bcl-2 ASODN對膽管癌細胞影響的實驗研究.pdf

1、膽管癌是起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤,文獻報道其發(fā)病率有逐年上升趨勢,由于膽管癌特殊的解剖位置和生物學特性,其治療效果差,雖經(jīng)數(shù)十年努力,膽管癌治療的預后并無明顯改善。一隨著膽管癌研究的不斷深入,人們開始從基因水平探索其治療方案,封閉單個基因表達的反義概念由Zamecnik和Stephenson首次描述,20多年來,許多研究證明反義寡核苷酸(ASODN)有特異性抑制基因表達的能力。本研究用免疫組化法證實了膽管癌組織中Bc1-2蛋白呈高表

2、達,評價了Bc1-2表達在膽管癌發(fā)生及預后推測中的作用;進一步通過實驗肯定了、Bc1-2 ASODN特異性抑制Bc1-2表達的能力;觀察了Bc1-2 ASODN對化療藥物足葉乙甙(VP-16)抑制膽管癌細胞生長和誘導癌細胞凋亡的影響;探討了Bc1-2 ASODN作用的分子機制,為膽管癌的反義基因治療提供實驗依據(jù)。 第一章 膽管癌組織中Be1-2表達及其臨床意義 目的:檢測正常膽管和膽管癌組織中細胞凋亡相關蛋白Bc1-2

3、的表達,分析膽管癌組織中Bc1-2蛋白表達與膽管癌臨床病理參數(shù)及其術(shù)后生存率的關系,探討B(tài)c1-2表達在膽管癌發(fā)生、發(fā)展的作用,評價其在膽管癌預后判斷中的價值。 方法:免疫組化SP法檢測36例膽管癌和10例正常膽管石蠟切片標本中Bc1-2蛋白的表達,SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析其表達與膽管癌臨床病理參數(shù)和術(shù)后生存率的關系,生存率計算采用Kaplan-Meier法,Log-rank檢驗比較生存曲線。 結(jié)果:膽管癌組織中Bc

4、1-2陽性表達率為47.2[％](17/36),正常膽管組織Bc1-2的陽性率10.0[％]0(1/10),兩者比較差異有顯著性;低分化的膽管癌Bc1-2陽性表達率75.0[％](6/8)與中分化者46.2[％](6/13)和高分化者33.3[％](5/15)比較,差異有顯著性;Bc1-2陽性表達率在腫瘤大小及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面比較差異無顯著性意義;Bc1-2陰性組術(shù)后1、3、5年存活率分別為82[％],55[％]和25[％],中位生

5、存時間為24個月，陽性組分別為33％，9％，無5年生存者，中位生存時間為9個月，兩組比較，生存率的差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論：Bcl-2在膽管癌組織中呈高表達，Bcl-2高表達在膽管癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起促進作用；Bcl-2表達狀態(tài)可能是膽管癌的預后因素之一，陽性表達多提示預后不良。 第二章Bcl-2 ASODN對人膽管癌QBC939細胞生長和凋亡的影響 目的：檢測膽管癌細胞株QBC939中Bcl-2蛋白表達，觀

6、察Bcl-2ASODN對膽管癌細胞株QBC939生長和凋亡的影響，探討以Bcl-2為靶的膽管癌基因治療的可行性。 方法：①常規(guī)培養(yǎng)膽管癌細胞株QBC939；②免疫細胞化學SP法檢測膽管癌細胞株QBC939中Bcl-2表達；③設計、合成特異性靶向Bcl-2 ASODN；④應用脂質(zhì)體將Bcl-2ASODN轉(zhuǎn)染人膽管癌QBC939細胞；⑤采用臺盼藍拒染試驗檢測細胞存活率；⑥采用克隆形成試驗檢測克隆形成率。 結(jié)果：①Q(mào)BC939

7、細胞株中Bcl-2蛋白呈陽性表達； ②臺盼藍拒染試驗顯示Bcl-2ASODN處理24h，48h及72h后活細胞計數(shù)明顯低于對應的無義寡聚核苷酸(NSODN)組和對照組，而NSODN組在24h，48h和72h與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義；③克隆形成試驗顯示NSODN組和對照組細胞培養(yǎng)第10天即可見明顯克隆形成，至第14天時克隆數(shù)目多、克隆大，周圍有較多散在的細胞。而ASODN組細胞于培養(yǎng)第13天時才出現(xiàn)克隆，且克隆小、數(shù)量少，僅少數(shù)散在