心力衰竭家兔左室瞬間外向鉀通道重構(gòu)及氯沙坦和辛伐他汀干預(yù)研究.pdf

1、本文研究目的：觀察心力衰竭(簡稱心衰)家兔左心室瞬間外向鉀通道重構(gòu)狀況及氯沙坦和辛伐他汀的干預(yù)作用，以探討血管緊張素II受體1拮抗劑和他汀類降脂藥物影響衰竭心肌電生理特性的分子機(jī)制。 方法： (1)家兔心衰模型的建立和動物分組：A．假手術(shù)組：12只，手術(shù)方法同心衰組，但僅冠狀動脈下穿線而不結(jié)扎。B．心衰組：11只，結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立缺血性心衰模型。C．氯沙坦治療組：13只，結(jié)扎冠狀動脈左前降支術(shù)后第三日開始，連續(xù)口

2、服氯沙坦10周(10mg／kg／d)。D．辛伐他汀治療組：10只，結(jié)扎冠狀動脈左前降支術(shù)后第三日開始，連續(xù)口服辛伐他汀10周(10mg／kg／d)。 (2)術(shù)前和術(shù)后lO周，做超聲心動圖檢查。測量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左房直徑(LA)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)。術(shù)后10周行左心導(dǎo)管檢查，在完成血流動力學(xué)指標(biāo)測定后，立即開胸，取出心臟秤取心臟重量(HW)。然后，立即心臟灌流做細(xì)

3、胞電生理檢查，或切取左室遠(yuǎn)離梗死部位心肌組織分層后液氮凍存?zhèn)渥龇肿由飳W(xué)檢查，或置于1O％的中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察其病理變化。 (3)采用酶解法分離得心室肌細(xì)胞，膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)記錄各組家兔左室各層心肌心肌細(xì)胞膜電容、瞬間外向鉀電流(Ito)曲線。各離子流大小以電流密度表示，即電流幅度與細(xì)胞膜電容大小的比值(pA／pF)。將每一鉗制電壓下平均電流密度大小繪制成電流密度．電壓曲線。

4、 (4)采用Trizol-氯仿一異丙醇法提取各組家兔左室組織總RNA，取總RNA做逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳和圖像掃描，測目標(biāo)基因和GAPDH條帶的OD值，用兩者OD值的比值代表目的基因的相對表達(dá)含量。評價各組家兔左室各層心肌Kvl．4、Kv4．2和Kv4．3mRNA表達(dá)水平。 (5)提取各組家兔左室膜蛋白，應(yīng)用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)行SDS．聚丙酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。爾后

5、行免疫印跡，ECL顯像。掃描X光片后，將所得圖像通過軟件進(jìn)行分析，檢測并計算各組Kvl4、Kv4．2和Kv4．3蛋白表達(dá)與內(nèi)對照B-actin的表達(dá)量象素灰度的比值。 結(jié)果： (1)心室重構(gòu)及心功能：與假手術(shù)組比較，心衰組家兔HW、HW／BW顯著增加，心臟體積明顯擴(kuò)大，梗死區(qū)變薄、纖維化。LVEDD、LVESD及左室舒張末壓(LVEDP)顯著增大，EF和FS顯著降低(P均<0．01)。氯沙坦和辛伐他汀干預(yù)組上述變化明顯改

6、善(P均<0．01)。HE染色心衰組梗死區(qū)心肌細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)紊亂、有大量炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)纖維化顯著，非梗死區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大增生；氯沙坦和辛伐他汀組上述變化明顯減輕。 (3)各組家兔左室心肌細(xì)胞膜電容：心衰組家兔各層心肌細(xì)胞膜電容顯著大于假手術(shù)組，氯沙坦和辛伐他汀干預(yù)組家兔各層心肌較心衰組顯著降低，但仍大于假手術(shù)組，而氯沙坦組較辛伐他汀組降低更為顯著(P均<0．01)。每組三層心肌細(xì)胞間膜電容無顯著性差異(胸>0．05)

7、。 (4)各組家兔左室心肌細(xì)胞的最大Ito密度(+70rev時)：心衰組家兔左室各層心肌最大Ito密度較假手術(shù)組均顯著降低(P均<0．01)，心內(nèi)膜(ENDO)、中膜(M)、心外膜(EPI)較假手術(shù)組分別降低了28％、44％和42％，中外膜降低更為顯著。氯沙坦和辛伐他汀干預(yù)組左室各層心肌最大k密度顯著高于心衰組(P均<0．01)，氯沙坦組和辛伐他汀組兩組間各層心肌細(xì)胞最大I協(xié)密度無顯著性差異(P>0．05)。 (5)各組

8、家兔左室壁心肌Ito密度的跨壁梯度：各組家兔左室心肌均存在跨室壁I協(xié)密度梯度，ENDO的I協(xié)密度最低，顯著低于M和EPI&,肌細(xì)胞(P<0．01)，而M和EPI心肌細(xì)胞間無顯著性差異(P>O．05)。心衰組家兔跨室壁Ito密度梯度較假手術(shù)組減小(ENDO／M和ENDO／EPI比值增加)(P0．05)。 (6)各組家兔左室Kvl．4、Kv4．2和Kv4．3

9、mRNA表達(dá)：心衰家兔左室各層心肌Kvl．4、Kv4．2和Kv4．3mRNA表達(dá)均低于假手術(shù)組(P均<0．01)，其中，Kvl．4mRNA表達(dá)在內(nèi)、中、外膜分別降低了30％、44％和45％，中外膜降低更為顯著；Kv4．2mRNA表達(dá)在內(nèi)、中、外膜分別降低了44％、43％和50％；Kv4．3mRNA表達(dá)在內(nèi)、中、外膜分別降低了39％、37％和38％。Kv4．2和Kv4．3mRNA表達(dá)在各層心肌降低程度一致。氯沙坦組和辛伐他汀組家兔左室各層

10、心肌Kvl．4、Kv4．2和Ky4．3mRNA表達(dá)較心衰組明顯上調(diào)(P<0．01)。氯沙坦組和辛伐他汀組兩組間各層心肌Kvl．4、Ky4．2和Kv4．3mRNA表達(dá)無顯著性差異(P>O．05)。各組家兔Kvl4mRNA在左室心肌表達(dá)存在跨壁梯度，ENDO表達(dá)水平最低，顯著低于M和EPI&,肌(P<0．01)，而M和EPI,I~肌間無顯著性差異(P>O．05)。心衰組家兔左室Kvl．4mRNA跨壁梯度較假手術(shù)組減小(ENDO／M和ENDO

11、／EPI比值增加)(P<0．05)。而氯沙坦組和辛伐他汀組Kvl4mRNA跨壁梯度與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P>0．05)。各組家兔左室Kv4．2和Kv4．3mRNA在各層心肌呈均勻表達(dá)，不存在跨壁梯度。 (7)各組家兔左室Kvl．4、Kv4．2和Kv4．3蛋白表達(dá)：心衰組家兔左室各層心肌Kvl．4、Kv4．2和Kv4．3蛋白表達(dá)均低于假手術(shù)組(尸均<0．01)，其中，Kvl．4蛋白表達(dá)在內(nèi)、中、外膜分別降低了38％、52％和

12、51％，中、外膜降低更為顯著；Kv4．2蛋白表達(dá)在內(nèi)、中、外膜分別降低了58％、59％和52％；Kv4．3蛋白表達(dá)在內(nèi)、中、外膜分別降低了42％、39％和37％。Kv4．2和Kv4．3蛋白表達(dá)在各層心肌降低程度一致。氯沙坦組和辛伐他汀組家兔左室各層心肌Kvl4、Kv4．2和Kv4．3蛋白表達(dá)較心衰組明顯上調(diào)(P均<0．01)。氯沙坦組和辛伐他汀組兩組間左室各層心肌Kvl．4、Kv4．2和Kv4．3蛋白表達(dá)無顯著性差異(P>O．05)。各

13、組家兔左室心肌Kvl4蛋白表達(dá)存在跨壁梯度，ENDO表達(dá)水平最低，顯著低于M和EPI,I~,肌(P<0．01)，而M和EPI,15~肌間無顯著性差異(P>O．05)。心衰組家兔Kvl．4蛋白跨壁梯度較假手術(shù)組減小(ENDO／M和ENDO／EPI比值增加)(P<0．05)。而氯沙坦組和辛伐他汀組家兔左室Kvl．4蛋白跨壁梯度變化不明顯，與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P>O．05)。各組家兔左室Ky4．2和Kv4．3蛋白在各層心肌呈均勻表達(dá)，

14、不存在跨壁梯度。 結(jié)論： (1)結(jié)扎家兔冠狀動脈前降支能夠成功建立心力衰竭模型，氯沙坦和辛伐他汀能夠防治心衰家兔心室重構(gòu)和心功能的降低。 (2)家兔左室心肌Ito密度存在明顯的跨壁梯度，心衰時左室各層心肌k密度降低并且該梯度減小。 (2)家兔左室心肌Kvl．4mRNA和蛋白在左室壁呈跨壁表達(dá)，Ky4．2和Ky4．3mRNA和蛋白呈均勻表達(dá)，心衰時各層心肌Kvl．4、Ky4．2ff*tKv43mRNA和蛋白