奧美沙坦通過拮抗心肌錨定重復(fù)蛋白減輕小鼠心臟重構(gòu)及心力衰竭.pdf

1、研究背景:
　　 心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，為心血管疾病最常見的死因。心力衰竭的病死率高，5年存活率與惡性腫瘤相仿，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前臨床上能夠改善心力衰竭預(yù)后的藥物主要有β受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)以及醛固酮受體拮抗劑等。其中，奧美沙坦酯，作為一種新型血管緊張素ⅡAT1受體阻斷劑，口服后在小腸壁完全去酯轉(zhuǎn)化成活性代謝產(chǎn)物奧美沙坦(RNH-6270)而起作用。既往研

2、究表明:奧美沙坦酯在降低舒張壓方面明顯優(yōu)于其他同類產(chǎn)品，而且該藥服藥劑量小、咳嗽等副作用少，被視為一線降壓藥物的良好選擇。近些年最新研究表明:奧美沙坦酯在降壓的同時能顯著減輕心肌重塑，對心、腎等靶器官具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，探索奧美沙坦酯新的作用機(jī)制，將為預(yù)防和治療心衰藥物的研發(fā)提供有效的新靶點。
　　 近十年來，大量的臨床及動物實驗研究證明:心肌錨定重復(fù)蛋白(cardiacankyrin repeat p

3、rotein，CARP)是心肌肥厚及心力衰竭的新型標(biāo)志物，在心肌肥厚及心力衰竭中表達(dá)顯著升高。同時有研究表明:血管緊張素Ⅱ、主動脈弓縮窄(TAC)手術(shù)均可誘導(dǎo)CARP的表達(dá)升高，參與心肌肥厚及心力衰竭的病理生理過程。而奧美沙坦主要通過特異性的阻斷血管緊張素ⅡAT1受體發(fā)揮一系列的藥理作用，那么奧美沙坦對CARP是否有干預(yù)作用以及CARP是否是奧美沙坦減輕心肌重塑、改善心功能的新的作用靶點，至今沒有相關(guān)報道。因此，我們設(shè)想CARP可能是奧

4、美沙坦新的作用靶點，奧美沙坦通過特異性阻斷AT1受體下調(diào)CARP的表達(dá)而發(fā)揮減輕心肌重塑、改善心功能的作用。那么，奧美沙坦又是怎樣通過下調(diào)CARP的表達(dá)而發(fā)揮減輕心肌重塑、改善心功能的作用的呢？盡管有證據(jù)表明:表達(dá)CARP的基因突變參與肥厚性心肌病及擴(kuò)張型心肌病的病理過程，但是過表達(dá)CARP對心肌肥厚及心力衰竭的利弊還不清楚，其作用機(jī)制也不明確。當(dāng)然，眾多研究表明:CARP與肌聯(lián)蛋白和肌鈀蛋白的結(jié)合增加可能導(dǎo)致肥厚性心臟病，且CARP與

5、心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，可能參與Calpains調(diào)節(jié)的促進(jìn)心肌肥厚及心衰的信號通路，包括calcineurin，p53等信號分子。因此，我們推測CARP對心肌細(xì)胞有損害作用，抑制CARP的表達(dá)及干預(yù)其作用過程可能是治療心衰的一項新的措施。
　　 研究目的:
　　 本研究以血管緊張素Ⅱ受體1拮抗劑（ARB）奧美沙坦干預(yù)治療，探索奧美沙坦與CARP的關(guān)系;并以AngⅡ刺激的心肌細(xì)胞肥大及主動脈弓縮窄(TAC)手術(shù)誘導(dǎo)心肌肥厚為

6、實驗?zāi)Ｐ?，采用腺病毒過表達(dá)的方法探討CARP對心肌肥厚及心衰的影響及其作用機(jī)制。本研究擬解決以下幾點:
　　 1，奧美沙坦與CARP的關(guān)系以及CARP是否是奧美沙坦新的作用靶點。
　　 2，過表達(dá)CARP對心肌細(xì)胞肥大及凋亡的影響。
　　 3，CARP是否能調(diào)節(jié)Calcineurin，p53及線粒體功能。
　　 4，過表達(dá)CARP是否加重TAC誘導(dǎo)的心肌重塑及心功能紊亂。
　　 研究方法:

7、　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　 體外分離培養(yǎng)1-3天的SD大鼠心肌細(xì)胞，分別加入1uM的血管緊張素AngⅡ，環(huán)孢素A(CsA)，奧美沙坦酯的活性成分奧美沙坦RNH-6270，及過表達(dá)CARP腺病毒處理。用Realtime-PCR分析ANP，β-MHC基因的表達(dá)水平，WesternBlot的方法檢測CARP，P53，P-P53，Bax，Calcineurin蛋白的表達(dá)水平。心肌細(xì)胞的存活率及細(xì)胞的凋亡分別采用MTT法和Hoche

8、st33258來檢測。而細(xì)胞面積大小是通過羅丹明鬼筆環(huán)肽染細(xì)胞骨架來觀察，并用Image J軟件測量定量。
　　 2.過表達(dá)CARP蛋白腺病毒的構(gòu)建
　　 采用PCR和體外連接的方法構(gòu)建過表達(dá)CARP蛋白的腺病毒。我們將大鼠乳鼠ANKRD1基因的全長cDNA插入到穿梭質(zhì)粒pDC316。利用Ad-MAX腺病毒系統(tǒng)將重組質(zhì)粒pDC316-ANKRD1與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxdelE13cre通過lipofectamin

9、e2000共同轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞，成功的包裝出過表達(dá)腺病毒pDC316-mCMV-EGFP-ANKRD1。細(xì)胞過表達(dá)CARP是通過轉(zhuǎn)染感染復(fù)數(shù)(MOI)為10的過表達(dá)腺病毒（Ad-CARP）48h，陰性對照為轉(zhuǎn)染等量的空病毒(Ad-EGFP)，小鼠心臟特異性過表達(dá)CARP則是直接將病毒注射到心臟左室壁。
　　 3.細(xì)胞免疫熒光
　　 為了檢測CARP及NFAT蛋白在細(xì)胞中的分布，我們將心肌細(xì)胞種在玻底皿中培養(yǎng)，通過標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)

10、胞免疫熒光步驟操作后，在confocal顯微鏡下觀察CARP及NFAT在細(xì)胞中的分布情況。同樣，我們也通過免疫熒光的方法檢測各組細(xì)胞中線粒體膜電位的變化情況。心肌細(xì)胞用TMRE(四甲基羅丹明已酯)和DAPI標(biāo)記后在confocal顯微鏡下觀察，通過紅色熒光的強(qiáng)弱變化來評價其線粒體膜電位的改變。
　　 4.心肌肥厚模型的建立
　　 8-10周齡C57BL/6雄性小鼠，體重約22-25 g，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔

11、注射麻醉，插管，開胸，按照文獻(xiàn)介紹的方法通過主動脈弓縮窄(TAC)制作左室壓力負(fù)荷模型。超聲測量是在TAC術(shù)后4周進(jìn)行，然后將小鼠處死。其中一部分TAC小鼠在手術(shù)后立即給予奧美沙坦藥物治療，給藥的方式是將藥物添加在食物里，治療四周后處死小鼠。另一部分小鼠在TAC術(shù)后兩周進(jìn)行腺病毒心肌注射，使心臟特異性過表達(dá)CARP，注射病毒2周后用超聲評價心功能指標(biāo)并處死。心肌細(xì)胞通過染麥胚凝集素測量其橫截面積大小。
　　 5.統(tǒng)計分析

12、　　 計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，統(tǒng)計顯著性差異分析采用t檢驗或者one-way ANOVA，多重比較采用Bonferroni's矯正。此外，變量的線性分析采用最小二乘法。在所有的統(tǒng)計中，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.奧美沙坦酯通過下調(diào)CARP的表達(dá)減輕TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚及改善心功能
　　 RT-PCR和Western Blot結(jié)果表明:在心肌細(xì)胞中，奧美沙坦酯的

13、活性成分奧美沙坦RNH-6270(10-6mol/L)能顯著的減輕AngⅡ刺激誘導(dǎo)的ANP基因和CARP蛋白表達(dá)水平的上調(diào)。在TAC小鼠中，奧美沙坦酯治療后顯著的抑制TAC誘導(dǎo)的CARP的升高。另外，與TAC小鼠相比，奧美沙坦酯治療4周后的TAC小鼠的心重體重比（HW/BW:TAC小鼠組:6.23±0.09mg/g;奧美沙坦治療組:5.02±0.33 mg/g，P＜0.01）和肺重體重比(LW/BW:TAC小鼠組:7.62±0.30 m

14、g/g，奧美沙坦酯治療組:6.04±0.17mg/g，P＜0.01)都顯著降低。這些結(jié)果都表明奧美沙坦酯通過下調(diào)CARP的表達(dá)從而減輕TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚及心功能紊亂，CARP是奧美沙坦作用的一個新的治療靶點。
　　 2.CARP是心肌肥厚的可靠的標(biāo)志物
　　 由于BNP（B-型鈉尿肽）是心肌肥厚及心衰的可靠的標(biāo)志物，因此我們研究TAC4-8周小鼠的ANKRDI與BNP表達(dá)的相關(guān)性。相關(guān)性研究表明心肌ANKRD1表達(dá)水平

15、與BNP的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.914，P＜0.01，n=15)。同時，還進(jìn)行ANKRD1與心重體重比的相關(guān)性研究，結(jié)果表明ANKRD1的表達(dá)與心重體重比呈正相關(guān)(r=0.934，P＜0.01)。Western Blot結(jié)果也表明:與假手術(shù)相比較，TAC手術(shù)能顯著的上調(diào)CARP的表達(dá)。同時，在細(xì)胞水平上AngⅡ刺激使CARP的表達(dá)呈時間和濃度依賴性升高。熒光免疫結(jié)果表明AngⅡ刺激促進(jìn)CARP在細(xì)胞質(zhì)中的定位，而這種作用可被calp

16、ain inhibitorⅠ所部分抑制。而免疫熒光結(jié)果表明轉(zhuǎn)染過表達(dá)CARP腺病毒主要使細(xì)胞質(zhì)中的CARP表達(dá)增加。這些結(jié)果都表明CARP是心肌肥厚的可靠的標(biāo)志物。
　　 3.過表達(dá)CARP加重AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大
　　 單獨轉(zhuǎn)染過表達(dá)CARP腺病毒能使ANP，β-MHC的表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，在AngⅡ刺激的病理狀態(tài)下能進(jìn)一步上調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的肥厚標(biāo)志基因ANP，β-MHC的表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。由于ca

17、lcineurin/NFAT信號通路是一條很重要的促肥厚的分子通路，因此我們檢測CARP對calcineurin/NFAT通路的影響，進(jìn)一步確定CARP促進(jìn)心肌肥厚的作用。Western結(jié)果表明過表達(dá)CARP能上調(diào)calcineurin的表達(dá)(P＜0.01);而細(xì)胞免疫熒光可以觀察到過表達(dá)CARP使NFAT發(fā)生核轉(zhuǎn)位。通過細(xì)胞面積的檢測，發(fā)現(xiàn)CARP可以進(jìn)一步加重AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，且這種作用被calcineurin的抑制劑Cy

18、closporinA(CsA)所抑制。這些結(jié)果表明CARP主要通過calcineurin/NFAT信號通路促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。
　　 4.過表達(dá)CARP促進(jìn)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡
　　 MTT和Hochest檢測結(jié)果都表明過表達(dá)CARP顯著降低心肌細(xì)胞生存率及增加心肌細(xì)胞的凋亡。為了探討出CARP促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們檢測與凋亡有關(guān)蛋白的表達(dá)，Western結(jié)果表明CARP能進(jìn)一步促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的P53，P53磷酸化蛋白P-

19、P53，及線粒體中Bax蛋白表達(dá)的增加。此外，通過四甲基羅丹明已酯檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的線粒體膜電位，confocal顯微鏡觀察結(jié)果表明過表達(dá)CARP降低線粒體膜電位，通透性增加。
　　 5.心臟過表達(dá)CARP加重TAC誘導(dǎo)的心肌重塑及心功能紊亂
　　 通過心肌注射腺病毒使心臟特異性過表達(dá)CARP。與TAC小鼠相比，注射過表達(dá)CARP腺病毒2周后的TAC小鼠，其心重體重比顯著增加(TAC+Ad-CARP組:8.69±0.3

20、8 mg/g vs.TAC+Ad-EGFP組:6.04±0.15 mg/g，P＜0.01)。類似的，肺淤血指數(shù)肺重體重比在注射過表達(dá)CARP的TAC小鼠中明顯增加(11.0±1.25mg/g vs.6.97±0.38 mg/g，P＜0.05)。其次，TAC手術(shù)誘導(dǎo)的心肌橫截面積及ANP的表達(dá)水平都因為過表達(dá)CARP而顯著增加(p＜0.01)。超聲結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染過表達(dá)CARP的TAC小鼠中左室舒張末內(nèi)經(jīng)(LVESd)及左室收縮末內(nèi)徑(LV

21、EDd)都比注射空病毒的TAC小鼠大(p＜0.05)，且左室短軸縮短率(LVFS％)顯著下降(p＜0.05)。此外，提取心臟組織蛋白，western結(jié)果表明心臟特異性過表達(dá)CARP的TAC小鼠中calcineurin，P53，P-P53的表達(dá)及Tunel檢測的細(xì)胞凋亡陽性率顯著升高。這些結(jié)果都表明過表達(dá)CARP加重TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚及心功能紊亂。
　　 結(jié)論
　　 1.奧美沙坦酯可以抑制CARP的表達(dá)及其對心臟的損害作