糖尿病兔心肌梗死后瞬間外向鉀離子通道的變化及纈沙坦干預(yù)研究.pdf

1、研究背景:
　　 糖尿病和冠心病是目前臨床常見的兩種疾病，糖尿病合并心肌梗死患者室性心律失常發(fā)生率明顯增加，死亡率也隨之增加。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者并發(fā)室性心律失常與梗死后細(xì)胞和組織水平的電重構(gòu)即離子通道重塑有關(guān)。離子通道重塑包括離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)、調(diào)控和相關(guān)蛋白伴侶的改變。這些病理生理重塑主要發(fā)生于鈉通道、鉀通道、鈣通道、鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體、縫隙連接蛋白、超極化激活的非選擇性陽離子通道等。上述變化促使動(dòng)作電位時(shí)程延長，復(fù)極離散

2、度增加，傳導(dǎo)異常，使得心肌電生理特性發(fā)生改變而出現(xiàn)電學(xué)的失穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致致命性心律失常和心臟性猝死的發(fā)生。
　　 糖尿病是一組由于胰島素分泌缺陷和(或)胰島素作用缺陷導(dǎo)致的以慢性血糖水平增高為特征的代謝異常綜合征。其中，2型糖尿病約占90％，其病因未明，多數(shù)患者確診時(shí)已存在慢性并發(fā)癥，如心、腦、腎、眼、神經(jīng)等部位病變，這也是2型糖尿病致殘、致死的主要原因。目前公認(rèn)高血糖是糖尿病各種慢性并發(fā)癥的主要誘發(fā)因素，但高血糖并非直接參與并

3、發(fā)癥形成，而是高血糖先引起體內(nèi)多種生化指標(biāo)的改變，進(jìn)而損害各個(gè)臟器導(dǎo)致并發(fā)癥的發(fā)生。既往國內(nèi)外研究高血糖引起的生化改變機(jī)制復(fù)雜多樣，如非酶類糖化過程增強(qiáng)、氧化還原應(yīng)激反應(yīng)、醛糖還原酶激活、二?；视?蛋白激酶C通路活性增加等。但糖尿病并發(fā)癥發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，其具體的病理生理及分子機(jī)制至今尚未完全闡明。糖尿病的心血管系統(tǒng)并發(fā)癥嚴(yán)重影響糖尿病患者的臨床預(yù)后，而冠心病及自主神經(jīng)病變則為引起糖尿病患者心力衰竭和猝死發(fā)生率增加的重要因素。除了血管

4、病變外，心肌細(xì)胞功能本身也存在明顯異常，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞收縮力下降及電生理特性的改變，后者又表現(xiàn)為心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程顯著延長。鉀通道電流是引起心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極的重要電流，糖尿病對心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響，部分是通過對鉀離子通道的影響而導(dǎo)致。人們應(yīng)用動(dòng)物模型來研究糖尿病對心肌的影響，至今己比較成熟的方法是鏈脲佐菌素或四氧嘧啶所導(dǎo)致的胰島素缺乏而誘發(fā)糖尿病，最常用的模型為鏈脲佐菌素模型，鏈脲佐菌素通過選擇性破壞胰島β細(xì)胞而誘發(fā)糖尿病。在這

5、一模型，心臟很快出現(xiàn)電生理和機(jī)械特性的改變，其電生理改變主要表現(xiàn)為動(dòng)作電位形態(tài)和時(shí)程的改變，在心電圖上則表現(xiàn)為QT間期延長及T波低平。對心肌細(xì)胞離子流研究的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)則為瞬間外向性鉀電流密度降低，這一變化在心室的心外膜心肌較心內(nèi)膜心肌明顯。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也顯示糖尿病心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程延長部分系由于外向復(fù)極鉀電流特別是瞬間外向鉀離子電流降低所致。
　　 現(xiàn)已明確，高血糖和急性心肌梗死后，心臟局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，其中

6、心環(huán)節(jié)是血管緊張素Ⅱ識(shí)別其特異性受體，通過一定的信號(hào)途徑激活G蛋白，進(jìn)而激活磷脂酶C，使細(xì)胞內(nèi)三磷酸肌酸和二酯酰甘油的合成增加，進(jìn)而激活心肌蛋白激酶C，過度表達(dá)蛋白激酶C激活絲裂素活化蛋白激酶，將信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄基因，引起多種生長刺激因子表達(dá)異常如c-fos等，磷酸化非常廣泛的蛋白質(zhì)底物，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白合成障礙、心肌細(xì)胞受損、心肌異常生長、心肌重塑、心功能減低。纈沙坦是一種特異的AT1受體競爭性拮抗劑，具有劑量依賴性，其通過

7、與AT1跨膜區(qū)氨基酸作用，阻止血管緊張素Ⅱ與AT1受體結(jié)合，阻斷血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。動(dòng)物研究己證實(shí)，纈沙坦可通過拮抗AT1受體減輕或改善心房纖維化所致的局部傳導(dǎo)異常，減少去甲腎上腺素的釋放，改善心房復(fù)極的不均一性，以及抑制心房電重構(gòu)。最新NAVIGATOR研究發(fā)現(xiàn)纈沙坦能有效預(yù)防新發(fā)糖尿病達(dá)14％，顯著降低空腹血糖、餐后2小時(shí)血糖。國內(nèi)對心肌梗死大鼠模型的研究證實(shí)纈沙坦可改善心肌梗死后心室肌的電重構(gòu)。但纈沙坦對糖尿病合并心肌梗

8、死的心室肌電重構(gòu)影響國內(nèi)外尚未見報(bào)道。糖尿病心肌梗死后是否進(jìn)一步影響心室肌電重構(gòu)也未見報(bào)道。本研究通過構(gòu)建糖尿病合并心肌梗死兔動(dòng)物模型，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法和Westernblot方法，對糖尿病合并心肌梗死后心室肌細(xì)胞瞬間外向鉀離子通道蛋白及基因表達(dá)的變化特點(diǎn)進(jìn)行了探討，并應(yīng)用不同劑量的纈沙坦對其進(jìn)行不同階段干預(yù)研究，以期發(fā)現(xiàn)其與室性心律失常的關(guān)系，以便指導(dǎo)臨床，改善糖尿病合并心肌梗死患者的預(yù)后。
　　 目的:
　

9、　 探討糖尿病兔心肌梗死后心室肌瞬間外向鉀離子通道蛋白及基因表達(dá)的變化以及纈沙坦對此變化的影響。
　　 方法:
　　 1.選擇健康新西蘭兔作為研究對象，通過高脂高糖喂養(yǎng)2個(gè)月后由耳緣靜脈注射四氧嘧啶(80mg/kg)制作糖尿病模型，成模后改為普通飼料繼續(xù)單籠喂養(yǎng)4個(gè)月，并隨機(jī)分為糖尿病+心肌梗死組(DM+MI組)、糖尿病假手術(shù)組(DM組)和非糖尿病假手術(shù)組(對照組)，通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支制作心肌梗死模型，最終每組14

10、只。手術(shù)后所有入選成活兔均常規(guī)喂養(yǎng)2個(gè)月，在3％戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉下迅速開胸取出心臟，剪取左心室梗死周圍區(qū)心肌組織，用冷生理鹽水沖洗后，DEPC水漂洗，分裝于凍存管置于液氮中保存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量PCR方法和Westernblot方法觀察心室肌鉀離子通道Kv4.2、Kv4.3和Kv1.4的基因及蛋白表達(dá)變化。
　　 2.選擇造模成功的新西蘭兔隨機(jī)分為6組:安慰劑組(placebogroup，GroupP)、低劑

11、量組(lowdoseGroup，GroupL)、中等劑量組(moderatedoseGroup，GroupM)、高劑量服藥6周組(highdoseofmedication6weeksGroup，GroupH1)、高劑量服藥8周組(highdoseofmedication8weeksGroup，GroupH2)和高劑量服藥10周組(highdoseofmedication10weeksGroup,GroupH3)，每組10只。GroupL

12、組給予5mg/(kg·d)纈沙坦灌胃6周;GroupM組給予10mg/(kg·d)纈沙坦灌胃6周;GroupH1組給予30mg/(kg·d)纈沙坦灌胃6周;GroupH2組給予30mg/(kg·d)纈沙坦灌胃8周;GroupH3組給予30mg/(kg·d)纈沙坦灌胃10周。GroupP組給予生理鹽水代替纈沙坦灌胃6周。分別在6周、8周或10周后，在3％戊巴比妥鈉麻醉下迅速開胸取出心臟，剪取左心室梗死周圍區(qū)心肌組織，用冷生理鹽水沖洗后，D

13、EPC水漂洗，分裝于凍存管置于液氮中保存?zhèn)溆?，采用?shí)時(shí)熒光定量PCR方法和Westernblot方法觀察心室肌鉀離子通道Kv4.2、Kv4.3和Kv1.4的基因及蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.DM+MI組和DM組兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平均顯著低于對照組(P＜0.05)，而Kv1.4顯著高于對照組(P＜0.05);DM+MI組兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平顯著低于DM組(P＜0.05

14、)，而Kv1.4并無顯著升高(P＞0.05)。
　　 2.DM+MI組和DM組兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表達(dá)量均顯著低于對照組(P＜0.05)，而Kv1.4顯著高于對照組(P＜0.05);DM+MI組兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表達(dá)量顯著低于DM組(P＜0.05)，而Kv1.4并無明顯變化(P＞0.05)。
　　 3.分別與GroupP比較，各治療組兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平均顯著升高(P＜

15、0.05)，而Kv1.4反而顯著降低(P＜0.05);GroupM、GroupH1、GroupH2和GroupH3兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平均顯著高于GroupL(P＜0.05)，而Kv1.4并無顯著升高(P＞0.05);與GroupH1比較，GroupH3兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平均顯著升高(P＜0.05)，而Kv1.4無顯著變化(P＞0.05);不論是Kv4.2、Kv4.3還是Kv1.4，在Group

16、H1和GroupH2間mRNA水平并無明顯變化(P＞0.05)。
　　 4.分別與GroupP比較，各治療組兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)，而Kv1.4反而顯著降低(P＜0.05);GroupM、GroupH1、GroupH2和GroupH3兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表達(dá)水平顯著高于GroupL(P＜0.05)，而Kv1.4并無顯著升高(P＞0.05);與GroupH1比較，Grou

17、pH3組兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)，而Kv1.4無顯著變化(P＞0.05);不論是Kv4.2、Kv4.3還是Kv1.4，在GroupH1和GroupH2間蛋白表達(dá)量并無明顯變化(P＞0.05)。
　　 5.分別與GroupP比較，各治療組在實(shí)驗(yàn)的終末期，其空腹血糖水平明顯下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.糖尿病兔心肌梗死后心室肌瞬間外向鉀離子通道基因及蛋白表達(dá)發(fā)