心肌梗死后心肌細胞內向整流鉀通道重構以及纈沙坦干預機制的研究.pdf

1、盡管當代社會醫(yī)療水平不斷進步，人們對健康生活方式的認識逐步加深，但心肌梗死（myocardial infarcion，MI）仍是臨床上最常見的心血管疾病之一，是我國人民健康面臨的重大威脅。我國每年約有54萬人死于心臟性猝死，近九成猝死原因是急性MI后發(fā)生的惡性心律失常。以往的研究發(fā)現(xiàn)室性心律失常及心源性猝死與鉀離子通道的重構有關。尤其是內向整流鉀通道(the inward rectifierpotassium channel，Kir)，

2、它是維持正常的動作電位的主要成分，維持靜息膜電位，參與動作電位早期和終末復極化。在心肌細胞中最豐富的內向整流鉀通道是IK1通道，心臟型為Kir2.1蛋白，被KCNJ2基因編碼。MI后心室肌細胞電重構的主要特點之一是IK1電流密度的下降，導致室性心律失常的發(fā)生或易感性增加。盡管目前臨床上已有多種抗心律失常藥物的應用，但這些成熟的抗心律失常藥物同時存在致心律失常作用，尤其是在QT間期延長者中應用。而MI后患者QT間期延長是提示惡性室性心律失

3、常甚至猝死發(fā)生的重要指標。因此目前已知的抗心律失常藥物在MI患者中的應用頗受局限。臨床MI患者多數(shù)伴有高血壓病等危險因素，而腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)拮抗劑可以顯著降低惡性心律失常的發(fā)生率，但具體機制尚未明確。因此，如能明確RAAS拮抗劑發(fā)揮抗心律失常作用的靶點，探明其作用機制，將對發(fā)現(xiàn)新的抗心律失常藥物、改善MI預后具有重要意義。
　　第一部分

4、 大鼠心肌梗死后內向整流鉀通道重構以及纈沙坦的干預作用
　　目的：
　　明確急性MI后大鼠梗死灶周和非梗死左心室游離壁區(qū)心肌細胞中內向整流鉀通道（Kir2.1蛋白）的表達水平，以及纈沙坦干預對該通道的效果。并且評價藥物干預后大鼠心率、血壓、室性心律失常易感性及血流動力學指標。
　　方法：
　　通過永久性結扎大鼠左冠狀動脈前降支建立急性MI模型，評價造模情況。造模成功后隨機分為假手術組（Control組）、假手術組

5、+纈沙坦組(Control+Valsartan組)、心肌梗死組（MI組）、心肌梗死+纈沙坦組（MI+Valsartan組）。利用小動物遙測及尾動脈測壓法記錄大鼠術后心率、血壓和心電圖。7天后提取梗死灶周和非梗死左心室游離壁區(qū)心肌組織，利用qPCR和Westen blot法檢測四組KCNJ2 mRNA水平和Kir2.1蛋白水平。
　　結果：
　　冠脈結扎術中心電監(jiān)測和術后Masson's染色證明造模成功。MI后7天，MI組大鼠

6、心率、血壓均較Control組和Control+Valsartan組升高，而MI+Valsartan組有所下降。MI后延長的QTc和QTcd亦在纈沙坦干預后趨于正常。此外纈沙坦有效改善MI后心臟射血分數(shù)等血流動力學指標。同時，MI組中KCNJ2 mRNA和Kir2.1蛋白水平較Control組和Control+Valsartan組降低，而MI+Valsartan組中纈沙坦改善了該離子通道的重構。
　　結論：
　　大鼠MI后I

7、K1通道表達水平顯著降低，纈沙坦干預可逆轉這一現(xiàn)象，同時伴隨著心律失常易感性降低。而在正常大鼠心肌中，纈沙坦對IK1通道的調控作用并無顯著統(tǒng)計學差異。
　　第二部分 纈沙坦改善心肌梗死后內向整流鉀通道重構的機制研究
　　機制一:纈沙坦通過抑制心肌梗死后激活的NF-κB-miR-16信號通路調控內向整流鉀電流
　　目的：
　　MicroRNAs是調控心律失常的重要因素之一。計算機預測microRNA-16(miR-

8、16)可以靶向調控KCNJ2基因。NF-κB可以調控miR-16的啟動子。本實驗主要驗證纈沙坦是否可以通過抑制MI后激活的NF-κB來下調miR-16的表達，且miR-16是否可以靶向調控KCNJ2基因的表達。
　　方法：
　　MI大鼠給予纈沙坦或生理鹽水灌胃7天，提取梗死灶周心肌組織RNA和蛋白。體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞和急性分離的新生大鼠心室肌細胞，轉染miR-16或給予血管緊張素Ⅱ及纈沙坦干預。Western blot

9、法檢測NF-κB p65，inhibitorκBα（IκB∞和Kir2.1蛋白水平，qPCR檢測KCNJ2 mRNA和miR-16表達水平。全細胞膜片鉗記錄IK1電流。熒光素酶檢測驗證KCNJ2是否為miR-16靶基因。CHIP驗證NF-κB對miR-16的DNA結合水平。
　　結果：
　　梗死灶周miR-16表達水平升高，伴隨KCNJ2/Kir2.1水平下降。體外轉染miR-16使之過表達，導致KCNJ2/Kir2.1表達

10、下調，伴隨著IK1電流密度減低。相反的，抑制miR-16或導致其結合位點突變增強了KCNJ2/Kir2.1的表達。MI大鼠接受纈沙坦干預后，升高的NF-κB p65和miR-16水平下調，而降低的IκBα和Kir2.1蛋白水平升高。體外試驗中，血管緊張素Ⅱ誘導的miR-16表達升高和KCNJ2/Kir2.1表達下降，同樣被纈沙坦抑制。而體外經纈沙坦處理的細胞中過表達miR-16，可消除纈沙坦對KCNJ2/Kir2.1的保護作用。體內和體

11、外實驗均證明缺氧環(huán)境下NF-κB p65表達上調，而IκBα表達下降，纈沙坦干預抑制了這一現(xiàn)象。而抑制NF-κB后，纈沙坦和NF-κB抑制劑對miR-16和KCNJ2/Kir2.1的調節(jié)作用相似。CHIP進一步驗證纈沙坦抑制NF-κB對miR-16的DNA結合水平。
　　結論：
　　MiR-16靶向調節(jié)KCNJ2基因的表達，MI后纈沙坦改善KCNJ2/Kir2.1的重構一定程度上依賴于NF-κB-miR-16信號通路。

12、>　　機制二:纈沙坦通過抑制心肌梗死后激活的酪蛋白激酶2調控內向整流鉀電流
　　目的：
　　MI后細胞內PKC等蛋白激酶對IK1的調節(jié)主要依賴于PIP2，并且其下游的調控機制鮮有報道。研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白激酶2(CK2)結合并磷酸化編碼Kir2.1蛋白的KCNJ2基因轉錄因子Spl。然而纈沙坦是否可以抑制MI后激活的CK2蛋白活性來影響KCNJ2基因表達以直接改善IK1通道重構還尚不明確。
　　方法：
　　MI大鼠給予

13、纈沙坦或生理鹽水灌胃7天，提取梗死灶周和非梗死左心室游離壁心肌組織RNA和蛋白。體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞和急性分離的新生大鼠心室肌細胞，轉染CK2或給予CoCl2、CK2抑制劑TBB及纈沙坦干預。Western blot法檢測CK2和Kir2.1蛋白水平，qPCR檢測CK2 mRNA和KCNJ2 mRNA表達水平。全細胞膜片鉗記錄IK1電流。EMSA檢測體內及體外Sp1的DNA結合活性。
　　結果：
　　梗死灶周和非梗死左心

14、室游離壁區(qū)心肌組織CK2蛋白表達升高，Kir2.1蛋白表達下降，伴隨著IK1電流密度減低，同時伴隨二者mRNA水平的變化。纈沙坦干預后逆轉了這一現(xiàn)象。體外培養(yǎng)的H9c2細胞中過表達CK2蛋白抑制了KCNJ2/Kir2.1的表達。相反的，抑制CK2蛋白可以增加KCNJ2/Kir2.1的表達。同樣的，在體外誘導缺氧環(huán)境中，纈沙坦同樣抑制缺氧后升高的CK2蛋白水平。體外經纈沙坦處理的細胞中過表達CK2，可消除纈沙坦對KCNJ2/Kir2.1的

15、保護作用。EMSA檢測證明CK2抑制Sp1的DNA結合活性，TBB抑制CK2后，Sp1的DNA結合活性升高。而MI后大鼠心肌組織中Sp1的DNA結合活性下降，纈沙坦干預后其活性上升。
　　結論：
　　AT1受體拮抗劑纈沙坦抑制CK2蛋白活性，增加Kir2.1蛋白表達，從而改善MI后IK1通道重構。
　　機制三:纈沙坦通過抑制心肌梗死后激活的Ⅰ型輔助性T細胞免疫反應調控內向整流鉀電流
　　目的：
　　MI導致

16、Kir2.1蛋白介導的IK1電流密度減低，伴隨著T細胞水平上調。細胞因子IFN-γ主要Th1細胞分泌。小膠質細胞中IFN-γ導致IK1電流密度下降。本實驗主要驗證MI后Th1細胞是否可以通過其分泌的細胞因子介導IK1通道重構，以及纈沙坦是否可以改善這一現(xiàn)象。
　　方法：
　　空白對照大鼠和MI大鼠給予纈沙坦或生理鹽水灌胃7天，提取梗死灶周心肌組織RNA和蛋白。體外培養(yǎng)急性分離的梗死灶周大鼠心室肌細胞和新生大鼠心室肌細胞，分別

17、給予纈沙坦干預和與分離的淋巴細胞共培養(yǎng)。流式細胞術分析大鼠心肌組織中Th1細胞數(shù)目。Elisa法檢測大鼠血漿中IFN-γ、IL-2和TNF-α水平。Western blot法檢測Kir2.1蛋白水平，qPCR檢測T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-10的mRNA表達水平。全細胞膜片鉗記錄IK1電流。
　　結果：
　　MI后Th1細胞數(shù)目及其分泌的細胞因子水平升高，Kir2.1蛋白水平下降。而MI大鼠纈沙坦干預后，Th