小鼠心肌細胞中的G蛋白門控內(nèi)向整流鉀通道及其功能.pdf

1、G蛋白門控內(nèi)向整流鉀離子通道（GIRK）是內(nèi)向整流鉀通道家族中的一員（Kir3），它有四個亞型，分別為GIRK1、GIRK2、GIRK3、GIRK4。GIRK通道廣泛分布于心臟和神經(jīng)組織中。G蛋白偶聯(lián)受體可通過影響通道的開放與關(guān)閉進而影響心肌細胞、神經(jīng)細胞以及神經(jīng)內(nèi)分泌細胞等的功能。在哺乳動物體內(nèi)，GIRK1和GIRK4主要分布于心房肌細胞和竇房結(jié)細胞，對調(diào)節(jié)心臟興奮性起重要作用，是心肌內(nèi)向整流鉀電流IKACh的分子基礎(chǔ)。
　　

2、 心臟中分布著交感神經(jīng)與迷走神經(jīng)纖維，迷走神經(jīng)興奮釋放遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh），與心肌細胞上的M2受體結(jié)合，激活相偶聯(lián)的對PTX敏感的Gi蛋白，GTP與Gα亞基結(jié)合，同時Gβγ與Gα-GTP解離，Gβγ直接激活GIRK導(dǎo)致通道開放，隨后具有GTP酶活性的Gα水解GTP，Gβγ再與Gα-GDP結(jié)合導(dǎo)致GIRK的失活。這一系列反應(yīng)被認為是許多與百日咳毒素（PTX）敏感G蛋白（Gi/Go）相偶聯(lián)的受體激活GIRK主要通路。GIRK興奮引起竇房結(jié)

3、、心房等部分的細胞膜電位發(fā)生超極化，使心率減慢，這是心臟迷走神經(jīng)影響心肌興奮性的分子基礎(chǔ)。對心室肌細胞是否存GIRK以及GIRK對心室肌細胞興奮性的貢獻存在爭議，有報道在一些動物心室肌細胞中發(fā)現(xiàn)有GIRK通道的表達，而其他報道則持相反的意見，而對心室肌細胞中GIRK通道的功能則所知甚少。
　　 關(guān)于調(diào)控心肌細胞靜息膜電位的IK1電流的分子基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的觀點認為是經(jīng)典的內(nèi)向整流鉀通道IRK，而對于象IRK一樣同樣具有內(nèi)向整流特性的G

4、IRK是否也參與了對心肌細胞靜息膜電位的調(diào)控則少有報道。因此，本研究將探討GIRK在小鼠心室肌細胞中的表達以及其在對包括靜息膜電位在內(nèi)的心肌興奮性調(diào)控中的作用。
　　 在上述研究的基礎(chǔ)上，將進一步研究GIRK在心衰小鼠心室肌細胞中的改變。
　　 目的：研究小鼠心室肌細胞中GIRK1/4通道的表達及功能；研究心衰時心室肌細胞中GIRK1/4通道表達及功能的改變；研究小鼠心室肌細胞基礎(chǔ)內(nèi)向整流鉀電流對Ba2+的敏感性。

5、>　　 方法：利用腺苷激活心肌GIRK通道。腺苷（adenosine）通過與其A1受體結(jié)合，激活相偶聯(lián)Gi蛋白進而激活GIRK通道。利用adenosine對GIRK電流的激活，tertiapin-Q對GIRK電流特異性阻斷，以及Ba2+對內(nèi)向整流鉀電流的阻斷作用，對心肌細胞中的內(nèi)向整流鉀電流進行研究。利用全細胞膜片鉗技術(shù)，記錄小鼠心室內(nèi)外膜下肌細胞中的GIRK電流；利用Western blot技術(shù)觀察小鼠心肌細胞中是否表達GIRK1和

6、GIRK4蛋白；利用免疫熒光技術(shù)觀察GIRK1和GIRK4在小鼠心房肌細胞、小鼠心室外膜下、內(nèi)膜下細胞上的表達。
　　 通過主動脈弓結(jié)扎，制備心衰小鼠模型，然后利用上述方法觀察心衰后心肌細胞GIRK的改變。
　　 利用Ba2+對IK1和GIRK電流的不同敏感性鑒別IK1和GIRK對內(nèi)向整流鉀電流的相對貢獻。
　　 結(jié)果：（1）應(yīng)用Langendorff方法分離正常小鼠心肌細胞，用全細胞膜片鉗分別記錄正常小鼠心室心

7、內(nèi)膜下、心外膜下肌細胞電流。我們首先觀察了膽堿受體激動劑oxo-M的作用，oxo-M可激活M2受體而激活GIRK通道，但是oxo-M的作用不專一，它還可以與M1受體結(jié)合，最終可導(dǎo)致GIRK的抑制。Adenosine可以通過其A1受體激活GIRK，本實驗主要選用adenosine為激活劑。在分離的小鼠心室肌細胞，膜電位從-40 mV到-120 mV誘發(fā)了明顯的內(nèi)向電流，而在-40mV以上的去極化電位激活了外向電流，此外向電流應(yīng)為外向鉀電流

8、，不是本研究的研究內(nèi)容。我們首先驗證記錄到的內(nèi)向電流是內(nèi)向整流鉀電流，基礎(chǔ)背景內(nèi)向電流曲線呈內(nèi)向整流電流特征，且可以被500μM Ba2+全部抑制，由此得出的內(nèi)向電流的翻轉(zhuǎn)電位在-80 mV左右，與通過Nernst方程計算得到的K+平衡電位-82.3 mV相符，說明記錄到的基礎(chǔ)內(nèi)向電流是內(nèi)向整流鉀電流。10μM adenosine引起內(nèi)向整流電流增加，加入GIRK特異型阻斷劑tertiapin-Q10 nM后，adenosine激活的電

9、流被抑制。500μM Ba2+可以將基礎(chǔ)和adenosine激活的電流完全阻斷。上述結(jié)果表明adenosine可以在小鼠心室肌激活GIRK電流。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明在測試的所有小鼠心室肌細胞中，10μM adenosine使心內(nèi)膜、外膜下細胞的內(nèi)向整流電流分別增加了22.3％±3.9和49.6％±23.1（相對于基礎(chǔ)電流）。而將心室內(nèi)膜、外膜下細胞的電流經(jīng)細胞體積（電容）計算電流密度后，無論基礎(chǔ)電流還是adenosine激活的電流，在兩類細胞

10、中都無顯著性差異，提示GIRK在小鼠心室心內(nèi)膜下和心外膜下心肌的表達無明顯差異。（2）利用Western blot技術(shù)，檢測了小鼠心房、心室心內(nèi)膜下和心外膜下心肌GIRK1和GIRK4蛋白的表達，結(jié)果表明在正常小鼠的心室心內(nèi)膜下和心外膜下心肌細胞中表達有GIRK1和GIRK4。經(jīng)過對GIRK1和GIRK4蛋白表達的密度統(tǒng)計，顯示正常小鼠心室內(nèi)、外膜下細胞之間沒有顯著性差異。（3）免疫熒光實驗通過激光共聚焦顯微鏡觀察到正常小鼠心房、心室內(nèi)

11、膜下、心室外膜下細胞有GIRK1和GIRK4表達。（4）對正常小鼠進行主動脈結(jié)扎制備心衰小鼠模型，成模后以前法分離心衰小鼠心室肌細胞，用全細胞膜片鉗方法記錄心衰小鼠心室外膜下細胞的內(nèi)向整流鉀電流，同樣用adenosine為激動劑，tertiapin-Q為特異性阻斷劑，記錄到心室外膜下細胞上有GIRK電流。Adenosine使心衰小鼠心室外膜下細胞的GIRK電流增加25.4％±8.8（相對于基礎(chǔ)內(nèi)向整流電流）。另外，應(yīng)用Western b

12、lot技術(shù)觀察到心衰小鼠的心房肌和心室內(nèi)膜下、外膜下心肌均有GIRK1和GIRK4的表達；應(yīng)用免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下，觀察到在心衰小鼠的心室肌細胞中存在GIRK1和GIRK4（由于心衰小鼠的心房已經(jīng)鈣化，不易得到心房肌細胞，故無心房細胞實驗）。比較正常與心衰小鼠心室外膜下心肌細胞10μMadenosine激活的GIRK電流，發(fā)現(xiàn)心衰小鼠心外膜下心肌細胞的GIRK電流要大于正常小鼠心外膜下心肌細胞GIRK電流，而兩種細胞的GIR

13、K電流密度無差別。上述結(jié)果說明心衰小鼠心室肌細胞的體積（膜電容）可能增大。正常和心衰小鼠心外膜下心肌細胞的基礎(chǔ)電流密度之間沒有顯著性差異。（5） Ba2+對基礎(chǔ)內(nèi)向整流電流的作用。通過全細胞記錄正常小鼠心室心內(nèi)膜下、心外膜下心肌細胞的基礎(chǔ)內(nèi)向整流電流的對Ba2+的量效關(guān)系，得到二者被Ba2+抑制的半數(shù)最大有效濃度分別是0.32μM與0.55μM。這些結(jié)果為進一步研究心室肌細胞中的內(nèi)向整流鉀電流的組成及包括靜息膜電位在內(nèi)的心肌興奮性調(diào)控奠

14、定了基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論：電生理實驗結(jié)果表明，在正常小鼠的心室心內(nèi)膜下、心外膜下心肌細胞中存在著GIRK，并且兩者的GIRK電流密度之間沒有顯著性差異；Western blot與免疫熒光實驗結(jié)果表明在正常小鼠心室肌細胞上表達有內(nèi)向整流鉀通道GIRK1/4。比較正常小鼠心室外膜下與心衰小鼠心室外膜下細胞中的GIRK電流密度，顯示心衰小鼠心室外膜下細胞中的GIRK電流密度降低，提示GIRK可能參與了心衰心肌細胞病生理學(xué)改變。Ba2+對