大鼠EPCs的標(biāo)記方法及TBI大鼠外周血中的EPCs的變化趨勢(shì).pdf

1、目的：本研究組前期臨床觀測(cè)發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷(TBI)患者外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)數(shù)量存在著先降低后上升的變化特征，為了進(jìn)一步研究外周血中EPCs變化機(jī)理，須建立相關(guān)的動(dòng)物研究平臺(tái)。本研究目的：1.建立一種大鼠外周血中EPCs的分離、標(biāo)記方法，使用流式細(xì)胞儀(FCM)雙抗體標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)大鼠外周血中EPCs的數(shù)量；2.利用大鼠液壓顱腦創(chuàng)傷(FPI)模型，探明TBI后大鼠外周血中EPCs的變化趨勢(shì)；3.探討TBI后EPCs與白細(xì)胞、血小板的

2、相關(guān)變化趨勢(shì)，為研究TBI后外周血中EPCs的變化機(jī)理提供參考。 方法：1.使用健康成年雄性WISTER大鼠共45只(體重300-350g，鼠齡12周)，分為假手術(shù)對(duì)照組(n=10)及TBI組(n=35)。假手術(shù)對(duì)照組大鼠僅給予10％水合氯醛腹腔注射麻醉。TBI組使用液壓打擊儀及小動(dòng)物立體定向儀，分別建立輕、中、重型大鼠閉合性顱腦液壓損傷模型，輕型組(n=10)液壓打擊力度為1atm，中型組(n=10)液壓打擊力度為2atm，重

3、型組(n=15)液壓打擊力度為3atm；2.TBI后24h，按照隨機(jī)原則從各TBI組中各抽取2只大鼠分別進(jìn)行頭顱MR檢查和腦組織切片HE染色，觀察TBI的影像和病理特征。其余大鼠分別于傷前24h和傷后不同時(shí)間點(diǎn)(3h、6h、24h、48h、72h、240h、336h)使用硬質(zhì)玻璃毛細(xì)采血管(()=1mm)取大鼠內(nèi)眥球后靜脈叢血液約1.1ml，進(jìn)行外周血EPCs測(cè)定，同時(shí)使用小動(dòng)物外周血細(xì)胞檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行白細(xì)胞和血小板測(cè)定；3.采用Fico

4、ll密度梯度離心法分離大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞，以CD34、CD133雙抗體陽(yáng)性作為EPCs標(biāo)志，使用CD34、CD133雙抗體標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，檢測(cè)大鼠外周血中EPCs的數(shù)量。 結(jié)果：對(duì)照組10只大鼠完成了各時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血循環(huán)中相應(yīng)指標(biāo)測(cè)定；輕型TBI組中1只大鼠因打擊后3天頭部切口感染被剔除，其余7只大鼠完成了各時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血循環(huán)中相應(yīng)指標(biāo)測(cè)定；中型TBI組中1只大鼠于打擊后48h死亡，其余7只大鼠完成了各時(shí)間點(diǎn)大鼠

5、外周血循環(huán)中相應(yīng)指標(biāo)測(cè)定；重型TBI組中2只于打擊后24h死亡，4只于打擊后48h死亡，其中1只因眼內(nèi)眥取血處嚴(yán)重感染被剔除，其余7只大鼠完成了各時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血循環(huán)中相應(yīng)指標(biāo)測(cè)定；實(shí)驗(yàn)中途死亡大鼠(n=6)的相應(yīng)數(shù)據(jù)作為死亡組進(jìn)行分析。1.大鼠外周血循環(huán)中存在表達(dá)CD34、CD133雙陽(yáng)性的EPCs，本研究測(cè)定顯示：正常大鼠外周血循環(huán)中EPCs為33-61個(gè)/20萬(wàn)單個(gè)核細(xì)胞，平均為47個(gè)/20萬(wàn)單個(gè)核細(xì)胞；2.TBI后大鼠外周血中E

6、PCs數(shù)量在傷后下降至正常水平以下，于傷后3h達(dá)最低點(diǎn)，至10-30個(gè)/20萬(wàn)單個(gè)核細(xì)胞，各組間下降幅度無(wú)顯著差異；3.TBI后大鼠外周血中EPCs數(shù)量在傷后3-6h漸升高至正常水平以上，于傷后6h達(dá)最高點(diǎn)，輕型組平均升至80個(gè)/20萬(wàn)單個(gè)核細(xì)胞，中型組平均升至68個(gè)/20萬(wàn)單個(gè)核細(xì)胞，重型組平均升至51個(gè)/20萬(wàn)單個(gè)核細(xì)胞，此后EPCs逐漸下降，傷后24h各組EPCs均降至正常水平；TBI后死亡的大鼠外周血中EPCs在傷后3h也下降至

7、最低點(diǎn)，在傷后3-6h雖有上升趨勢(shì)，但達(dá)不到正常水平，死亡前外周血中EPCs呈持續(xù)下降趨勢(shì)；4.TBI后大鼠外周血中EPCs數(shù)量變化與血小板、白細(xì)胞數(shù)量均無(wú)顯著相關(guān)。 結(jié)論：1.采用CD34、CD133雙抗體標(biāo)記技術(shù)結(jié)合使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)、可以良好地定量測(cè)定大鼠外周血中的EPCs；2.本實(shí)驗(yàn)顯示：與TBI患者傷后外周血中EPCs的變化特征相似，TBI后存活的大鼠外周血的EPCs水平同樣存在先降低，后增高，再逐漸降至正常的變化特征