大鼠TBI的CT灌注及EPCs對(duì)傷后腦血流變化和微血管影響的影像學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　 創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)的發(fā)生率位居創(chuàng)傷首位，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，其發(fā)生率持續(xù)升高，是導(dǎo)致患者傷殘和死亡的主要原因。傷后血腦屏障受到破壞，以及局部血流變化和損傷因子、氧自由基等因素的共同作用加劇了病情的惡化，導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域缺血缺氧，顱內(nèi)壓急劇增高，從而誘發(fā)腦疝的形成。
　　 在TBI的修復(fù)過(guò)程中，新生血管起著重要的作用，血管再生可以盡快恢復(fù)腦組織缺血區(qū)域的血供，改

2、善缺氧狀態(tài)，使瀕臨死亡的神經(jīng)元逐漸趨于正常。因此，早期關(guān)注損傷后腦血流灌注的變化以及水腫的情況，并及時(shí)采取有效治療，對(duì)于預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生以和改善預(yù)后都有重要的臨床意義。血管生成被認(rèn)為是TBI后的一種反應(yīng)性保護(hù)機(jī)制，能夠改善腦灌注，避免或減輕神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性損害。外源性的EPCs作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，它的主要作用很可能是參與損傷區(qū)域血管的生成、促進(jìn)和產(chǎn)生功能完善的新生血管而進(jìn)一步促進(jìn)損傷神經(jīng)組織的修復(fù)過(guò)程，極有可能成為T(mén)BI治療的一

3、種細(xì)胞干預(yù)方法。但是，目前有關(guān)EPCs 參與TBI后血管構(gòu)建的機(jī)制、EPCs及其參與形成新生血管在損傷區(qū)域的變化過(guò)程以及對(duì)神經(jīng)軸索修復(fù)的影響和作用等問(wèn)題均未完全闡明，而SPIO 標(biāo)記的EPCs 可被MRI 示蹤，有望用于TBI 修復(fù)過(guò)程中新生血管形成及其對(duì)神經(jīng)組織修復(fù)影響的有效活體監(jiān)測(cè)，動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)TBI的組織修復(fù)過(guò)程。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)TBI后血流灌注和相關(guān)病理生理學(xué)基礎(chǔ)的分析，以EPCs對(duì)TBI 進(jìn)行早期干預(yù)，評(píng)價(jià)移植的外源性

4、EPCs對(duì)TBI后腦血流灌注和致傷區(qū)域微血管變化產(chǎn)生的影響，闡明EPCs 可能的修復(fù)作用和價(jià)值，為T(mén)BI 修復(fù)的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)影像學(xué)基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 本研究前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)CT灌注成像與相關(guān)病理生理學(xué)的分析，探討TBI后腦血流變化規(guī)律和血腦屏障通透性的演變過(guò)程，然后選擇高灌注期之前移植磁性標(biāo)記的EPCs，干預(yù)TBI的修復(fù)過(guò)程。同時(shí)采用MR成像和CT灌注成像，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞歸巢和血流灌注的恢復(fù)情況，并結(jié)合免疫組化來(lái)

5、計(jì)數(shù)微血管密度的高低，進(jìn)而判斷SPIO-EPCs在TBI中的修復(fù)效果。
　　 材料和方法：
　　 1.大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷CT 灌注成像及相關(guān)病理生理學(xué)基礎(chǔ)的初步研究此部分實(shí)驗(yàn)選用SD 成年雄性大鼠，參照Feeney 自由落體裝置建立大鼠TBI 模型，按照傷后神經(jīng)功能評(píng)分，傷情大致控制在2級(jí)水平。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置三個(gè)組別，分別為正常對(duì)照組、假致傷組、TBI 致傷組，TBI 致傷組又分為2、6、12、24、48、72、120、16

6、8h時(shí)相組。傷后分別對(duì)各組進(jìn)行CTPI 掃描、腦含水量和血腦屏障通透性測(cè)定、以及組織病理學(xué)觀察。CTPI 掃描采用64 排螺旋CT，并對(duì)原始圖像進(jìn)行后處理，計(jì)算出感興趣區(qū)的腦血流量(CBF)、腦血容量(CBV)、表面通透性(PS)和平均通過(guò)時(shí)間(MTT)等參數(shù)。選取傷側(cè)大腦的損傷區(qū)域及健側(cè)鏡像區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)，計(jì)算灌注指標(biāo)的相對(duì)值，即傷側(cè)/健側(cè)(盡量減小個(gè)體差異及其他原因造成的誤差)。腦含水量的測(cè)定按照Elliott 公式計(jì)算，含水量百分

7、比=(濕重－干重)/濕重×100％；腦組織伊文思藍(lán)(EB)含量的檢測(cè)采用分光光度法，定量評(píng)價(jià)血腦屏障的功能受損情況。另外，用40g/L 多聚甲醛溶液灌注取材，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察各時(shí)相點(diǎn)的病理改變。最后，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析，判斷影像學(xué)變化與病理生理改變的相關(guān)性。
　　 2.磁標(biāo)記的外源性EPCs對(duì)大鼠TBI 血流灌注及微血管影響的實(shí)驗(yàn)影像學(xué)研究利用上述實(shí)驗(yàn)得出的TBI后血流變化規(guī)律，在選定的低灌注時(shí)相點(diǎn)(6h，1

8、2h)對(duì)TBI大鼠模型移植SPIO-EPCs。此部分實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)組別，分別為正常對(duì)照組、SPIO對(duì)照組、TBI 致傷組和SPIO-EPCs 移植組(SPIO-EPCs組)。移植后，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行MR 成像、CT 灌注成像、普魯士藍(lán)染色以及CD31免疫組化染色。MR 成像采用T1WI 軸位、T2WI 冠狀位以及軸位，在移植EPCs后2、24、48h 進(jìn)行掃描，主要觀察磁性標(biāo)記的EPCs的影像學(xué)分布情況，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)性地動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)移植細(xì)

9、胞。CTPI的掃描方法、參數(shù)以及后處理技術(shù)與實(shí)驗(yàn)第一部分相同，分別于傷后72、120、168h掃描觀察移植細(xì)胞后血流灌注以及通透性的演變過(guò)程。普魯士藍(lán)和免疫組化染色分別觀察移植后內(nèi)皮祖細(xì)胞的分布情況以及移植細(xì)胞干預(yù)后新生血管的數(shù)量和密度。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷CT 灌注成像及相關(guān)病理生理學(xué)基礎(chǔ)的初步研究正常對(duì)照組和假致傷組各項(xiàng)灌注參數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相對(duì)灌注值接近于1。
　　 PS值在正

10、常情況下定義為0。兩組間腦含水量和EB 含量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，病理學(xué)表現(xiàn)為正常腦組織。TBI 致傷組于傷后2h 損傷區(qū)域血流灌注驟降達(dá)最小值，2h～12h內(nèi)，相對(duì)腦血流量(rCBF)和相對(duì)腦血容量(rCBV)仍處于低灌注狀態(tài)，但有所升高。相對(duì)平均通過(guò)時(shí)間(rMTT)延長(zhǎng)，表面通透性(PS)增大。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，rCBF、rCBV 逐漸升高，直至傷后24h 開(kāi)始逆轉(zhuǎn)，傷側(cè)呈高灌注狀態(tài)，PS值達(dá)最大。
　　 48

11、h為高灌注的頂峰期，后逐漸趨于正常。腦含水量于傷后2h 開(kāi)始升高，48h 達(dá)到高峰期。傷后2h 血腦屏障通透性即開(kāi)始增加，24h 達(dá)最大值。
　　 通過(guò)Spearman 相關(guān)分析可知，rCBF與含水量之間的變化關(guān)系呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.905,p=0.002)，即傷后2h～48h，rCBF 越高，含水量越多，48h 至觀察結(jié)束時(shí)，rCBF逐漸降低，含水量也越少。rCBV與含水量的關(guān)系變化與rCBF 類似(r=0.901,p=

12、0.002)。
　　 PS與EB 含量的變化規(guī)律大體一致，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，證明兩者之間存在正相關(guān)(r=0.738,p=0.037)，傷后24h 之前兩者同步上升，之后同步下降大致趨于正常水平。
　　 2.磁標(biāo)記的外源性EPCs對(duì)大鼠TBI 血流灌注及微血管影響的實(shí)驗(yàn)影像學(xué)研究SPIO對(duì)照組于傷后2、24、48h時(shí)相點(diǎn)進(jìn)行MRI 掃描，未發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)域出現(xiàn)低信號(hào)范圍的明顯改變，各時(shí)相點(diǎn)，創(chuàng)傷區(qū)域腦組織普魯士藍(lán)染色也未

13、發(fā)現(xiàn)藍(lán)染的鐵磁顆粒分布區(qū)，說(shuō)明SPIO 本身不具有向創(chuàng)傷區(qū)域聚集的能力。SPIO-EPCs組也于上述時(shí)相點(diǎn)進(jìn)行MR 成像，2h時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)傷區(qū)域呈均勻高信號(hào)，無(wú)明顯低信號(hào)區(qū)域顯示，第24h 掃描，損傷區(qū)域出現(xiàn)點(diǎn)片狀低信號(hào)，至第48h，致傷區(qū)域內(nèi)低信號(hào)面積顯著增大，且顯示為均勻低信號(hào)。普魯士藍(lán)染色表明藍(lán)染細(xì)胞在創(chuàng)傷區(qū)域的分布與時(shí)間有明顯的關(guān)系，即隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大致呈一個(gè)從創(chuàng)傷區(qū)域周邊向中央?yún)^(qū)域聚集的過(guò)程。
　　 傷后72、120、1

14、68h，SPIO-EPCs組的A、B兩個(gè)亞組在同一時(shí)相點(diǎn)的rCBF、rCBV、rMTT和PS值基本無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05，(但72h的rCBV和144h的rMTT兩組之間有顯著性差異，P<0.05)。重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析的結(jié)果顯示，不同時(shí)相點(diǎn)SPIO-EPCsA、B 亞組與TBI 致傷組的rCBF、rCBV、PS 比較有顯著性差異(P<0.05)，而兩大組rMTT 比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。傷后各時(shí)相點(diǎn)的CD31+細(xì)胞與微血管

15、數(shù)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，SPIO-EPCs A、B 亞組之間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和微血管計(jì)數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；兩亞組與TBI 致傷組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即SPIO-EPCs組的CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和微血管計(jì)數(shù)均明顯高于TBI 致傷組。
　　 結(jié)論：
　　 1．通過(guò)建立傷情穩(wěn)定的大鼠TBI 致傷模型，分析其CT 灌注參數(shù)與腦含水量、血腦屏障通透性、病理學(xué)的變化以及兩者的相關(guān)性，得出CT 灌注的各項(xiàng)

16、參數(shù)能較好地反映大鼠創(chuàng)傷性腦水腫的分型和血腦屏障通透性的演變過(guò)程，因此可以作為一種在活體測(cè)量腦組織灌注狀況和水腫程度的無(wú)創(chuàng)性手段；
　　 2．SPIO 標(biāo)記的EPCs能歸巢至創(chuàng)傷組織，3.0T MR 成像結(jié)合普魯士藍(lán)染色顯示，標(biāo)記的EPCs在創(chuàng)傷組織內(nèi)的聚集，提示EPCs 可能參與創(chuàng)傷組織的修復(fù)；
　　 3．在特定的時(shí)相點(diǎn)，對(duì)大鼠TBI 模型靜脈移植SPIO-EPCs 干預(yù)其修復(fù)過(guò)程，結(jié)果表明，高灌注期的灌注量明顯下降，