HIF與EPCs成內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有高度自我更新和很強(qiáng)分化潛能的細(xì)胞.利用其分化為多種種類細(xì)胞的特殊能力,能作為損傷組織的修復(fù)以及新組織的形成的來源.骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)存在于全身血循環(huán)中,在特定細(xì)胞因子刺激和/或組織缺血反應(yīng)時(shí),動員到外周血循環(huán)中的EPCs增加并參加局部組織新生血管形成;另臍血中也含有大量EPCs,將其分離,在體外誘導(dǎo)培養(yǎng),可擴(kuò)增和分化為內(nèi)皮細(xì)胞,表達(dá)內(nèi)皮特異性成分,回

2、輸入體內(nèi),可靶向性地到缺血部位.因此EPCs能作為細(xì)胞載體將促進(jìn)或抑制血管生成基因輸送到血管生成部位,為調(diào)控出生后血管新生的有前景的策略.第一部分[目的]探討人的臍血、外周血中的EPCs體外分離,純化,誘導(dǎo)擴(kuò)增和分化為內(nèi)皮細(xì)胞的可行性,并檢測其表型和功能.[方法]新鮮臍血和健康成年人的外周血,使用Ficoll密度梯度離心法得單個(gè)核細(xì)胞,MACS法分離出臍血CD34+ 單個(gè)核細(xì)胞,在M-199培養(yǎng)基中,加入細(xì)胞因子(VEGF,bFGF),

3、體外培養(yǎng),誘導(dǎo)EPCs增殖,分化.通過流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮細(xì)胞CD31表型,RT-PCR法檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物ecNOS,flk-l/KDR基因水平的表達(dá),免疫組化驗(yàn)證蛋白水平的表達(dá),并進(jìn)一步通過NO活性的變化檢測內(nèi)皮細(xì)胞的功能.第二部分[目的]探討低氧誘導(dǎo)因子(HIF)基因轉(zhuǎn)染入EPCs,對其表現(xiàn)型改變的影響.[方法]真核表達(dá)載體pEGFP-C1攜帶綠色熒光蛋白GFP,外源性基因HIF插入其多克隆位點(diǎn)KpnI,BamH I,重組的質(zhì)

4、粒行酶切電泳鑒定,基因測序,與基因文庫中的核苷酸序列進(jìn)行核實(shí).細(xì)胞分離,純化,誘導(dǎo)培養(yǎng)同第一部分.外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后,細(xì)胞分組:A組,只加入細(xì)胞因子(VEGF,bFGF)誘導(dǎo)培養(yǎng).B組:轉(zhuǎn)染入空質(zhì)粒pEGFP-C1,且加入細(xì)胞因子(VEGF,bFGF).C組:轉(zhuǎn)染入pEGFP-HIF質(zhì)粒.D組:未加細(xì)胞因子誘導(dǎo).熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR檢測HIF的表達(dá).將四組細(xì)胞培養(yǎng)一周后,消化細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測CD3