深低溫冷凍保存角膜內皮細胞活性的實驗研究.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文深低溫冷凍保存角膜內皮細胞活性的實驗研究姓名：賈艷紅申請學位級別：碩士專業(yè)：眼科學指導教師：王麗婭20070418鄭州人學2007屆碩I。研究生畢業(yè)論文渫低溫冷凍保存角膜內皮細胞活件的實驗研究摘舞均采用三只角膜片作為實驗組。角膜片首先經過冷凍預處理，然后調節(jié)程控降溫儀其中一神程序進行冷凍降溫直至一80℃，最后放到一196℃液氮保存。氣體栓塞處死兔子后，摘除完整眼球，迅速拿至無菌室備用，沿角鞏膜緣外1～2mm將角膜全層

2、剪下，小心放于己備好的角膜瓶中，取組一液2ml加入其中，4℃冰箱浸泡10分鐘。依次在組二，組三，組四液中浸泡10分鐘，最后放于程控降溫儀中，調至其中一程序降溫直到結束后，最后將角膜瓶放入液氮中。保存一定時間后復溫，將角膜瓶從液氮中取出，迅速在40℃下復蘇融凍約1分鐘后即可取出，最后移除角膜瓶中的凍存液并再加入含有20％(FetusBloodserumFBS)的DMEM培養(yǎng)基沈脫(DimethylsulfoxideDMSO)，時間為lO分

3、鐘，最后去除沈脫液。染色固定，首先將O4％茜素紅數滴加入角膜片的內皮面上，染色3分鐘后用生理鹽水漂洗；其次用O25％苔盼藍數滴再加入到內皮面上染色2分鐘后，再用生理鹽水漂沈【4sl；再次用25％戊二醛2ml浸泡角膜片固定10分鐘后，再用生理鹽水漂洗。最后在顯微鏡下檢查角膜內皮細胞的存活率，以角膜片中央四個不同視野為標準，最后通過統(tǒng)計學處理，已a=O05為標準，尸(005為有統(tǒng)計學意義。結果對照組即未經過冷凍處理的新鮮兔角膜片顯微鏡檢查可

4、見內皮細胞排列整齊，緊密連接，茜素紅和苔盼藍聯合染色法可見細胞呈現紅色的六邊形輪廓，未見到染為藍色的細胞核，細胞間隙未見增大，整個視野中可見角膜內皮細胞大小一致形態(tài)完整。而實驗組即經過各種不同冷凍程序處理的角膜片經過顯微鏡檢查可發(fā)現，細胞間隙均有所增大，有些細胞排列仍然整齊，但細胞輪廓大多呈現圓形或不規(guī)則形狀，但其余很多方法凍存的細胞排列已經不規(guī)整，形態(tài)不清，細胞邊界不存在，細胞間隙明顯增大，而且可見到許多染為藍色的細胞核，有些照片可見

5、兩三個細胞融合，有些部分細胞成片缺失，甚至可見大片融合的細胞，整個視野僅殘留裸核。經過大量的對比實驗研究，發(fā)現在第～階段降溫速度為2“C／min時和第二階段降溫速度為5℃／min時角膜內皮細胞的存活率達到最高，而其它多種方法中可見染為藍色的細胞核或者大片融合的細胞，僅殘留藍色的裸核。第一階段的降溫速度vl在一20“C／rain與其它六種速度比較，P值均O05；第二階段的降溫速度v2在一5“C／min與其它六種速度比較尸值均O05，均有統(tǒng)