松材線蟲(chóng)低溫冷凍保存的研究.pdf

1、松材線蟲(chóng)的低溫冷凍保存能夠充分利用并收集各種來(lái)源的松材線蟲(chóng)，可為松材線蟲(chóng)的致病機(jī)理和生物防治技術(shù)的研究和應(yīng)用提供大量實(shí)驗(yàn)材料，并且不受時(shí)間和空間的限制。目前，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于松材線蟲(chóng)低溫冷凍保存的成功報(bào)道，國(guó)外關(guān)于這方面的報(bào)道也很少，尚缺乏系統(tǒng)的研究。本試驗(yàn)研究了松材線蟲(chóng)冷凍保存過(guò)程中冷凍方法、冷凍保護(hù)劑種類和濃度、預(yù)處理時(shí)間、解凍方式以及冷凍時(shí)間對(duì)冷凍保存效果的影響，結(jié)果如下：
　　 1.為了篩選玻璃化冷凍保護(hù)劑，將EG、GL和

2、、DMSO三種冷凍保護(hù)劑和無(wú)菌水按照不同比例配制成6種玻璃化保護(hù)液，比較不同玻璃化保護(hù)液對(duì)線蟲(chóng)的毒性作用與冷凍效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，單一的EG或GL的冷凍效果顯著優(yōu)于GL+EG混合液(P＜0.05)，前兩者之間的差異不顯著(P＞0.05)，單一的EG或GL作為冷凍保護(hù)劑效果最好。
　　 2.在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以低濃度EG和GL為預(yù)處理液，比較不同預(yù)處理液濃度對(duì)松材線蟲(chóng)冷凍效果的影響，以沒(méi)有經(jīng)過(guò)預(yù)處理的松材線蟲(chóng)作為對(duì)照。結(jié)果表明，

3、GL作為預(yù)處理劑的冷凍效果顯著高于EG(P＜0.05);經(jīng)過(guò)5％GL預(yù)處理的線蟲(chóng)存活率最高，為36.5％，相比其他試驗(yàn)組的冷凍效果顯著較好(P＜0.05)。
　　 3.通過(guò)1h、2h、3h、4h和5h的平衡時(shí)間對(duì)松材線蟲(chóng)進(jìn)行冷凍，比較比較不同平衡時(shí)間對(duì)松材線蟲(chóng)冷凍效果的影響，結(jié)果表明，平衡2h和3h的線蟲(chóng)凍后存活率最高，分別達(dá)到32.1％和32.6％，顯著高于1h、4h和5h(P＜0.05)。由此推斷，線蟲(chóng)平衡2-3h后進(jìn)行冷凍

4、，冷凍效果最好。
　　 4.將GL用無(wú)菌水分別配置成30％,40％,50％和60％系列濃度溶液，比較不同濃度冷凍保護(hù)劑對(duì)松材線蟲(chóng)冷凍效果的影響，結(jié)果表明，GL濃度為20％、25％時(shí)對(duì)松材線蟲(chóng)的冷凍效果最好，存活率為35.6％和36.2％，顯著高于其它的濃度(P＜0.05)。在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的蔗糖或海藻糖進(jìn)行冷凍保存，研究非滲透性保護(hù)劑對(duì)松材線蟲(chóng)冷凍效果的影響，結(jié)果表明，添加同一濃度的海藻糖或蔗糖，冷凍后的線蟲(chóng)存

5、活率差異不顯著(P＞0.05)；添加0.25M的蔗糖或海藻糖進(jìn)行冷凍，與其他試驗(yàn)組相比，冷凍效果顯著較好最好(P＜0.05)。
　　 5.以不同的解凍溫度20℃，30℃，40℃，50℃和60℃對(duì)冷凍24h的線蟲(chóng)分別進(jìn)行水浴解凍和干熱解凍，比較不同解凍方式和解凍溫度對(duì)松材線蟲(chóng)冷凍效果的影響，結(jié)果表明，干解凍的方式明顯不能用于線蟲(chóng)的冷凍保存；水浴解凍溫度為40℃時(shí)，線蟲(chóng)的凍后活率達(dá)到42.2％，顯著高于其他試驗(yàn)組(P＜0.05);<

6、br>　　 6.在玻璃化冷凍保存的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了7組降溫程序，采用程序化冷凍法對(duì)松材線蟲(chóng)進(jìn)行冷凍，篩選最合適的降溫程序。結(jié)果表明，采用降溫程序5（在4℃以1℃/min的速率降溫至-6℃，再以20℃/min的速率降溫至-40℃，然后以10℃/min的速率升溫至-20℃，最后以1℃/min的速率降溫至-45℃，迅速投入液氮）的凍后線蟲(chóng)活率達(dá)到41.1％,顯著高于其他降溫程序(P＜0.05)。
　　 7.以低濃度的GL、EG及二者的

7、組合為冷凍保護(hù)劑，并添加0.25M的蔗糖進(jìn)行程序化冷凍保存，篩選最適的程序化冷凍保護(hù)劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，10％-15％GL作為程序化冷凍保護(hù)劑的冷凍效果最好，凍后存活率分別為50.9％和49.6％，二者差異不顯著(P＞0.05)。
　　 8.分別采用玻璃化冷凍法和程序化冷凍法對(duì)松材線蟲(chóng)進(jìn)行冷凍保存，比較不同株系線蟲(chóng)的冷凍效果及冷凍后的繁殖情況，結(jié)果表明，不同株系間的冷凍效果差異不顯著(P＞0.05)；程序化冷凍松材線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的冷凍效