深低溫凍存對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)功能影響研究.pdf

1、目的：
　　 1．探討深低溫凍存不同時(shí)限對(duì)HUVEC在凝血、抗凝、舒縮血管等生物分泌功能方面的影響。
　　 2．探討深低溫凍存對(duì)HUVEC表面的細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)產(chǎn)生的影響，可能會(huì)在防治內(nèi)膜增生以及血管移植后狹窄閉塞提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
　　 3．探討HUVEC凍存不同時(shí)限對(duì)內(nèi)皮再形成血管管腔能力的影響，內(nèi)皮經(jīng)過(guò)凍存后在那些方面會(huì)發(fā)生改變，是否具有完整的內(nèi)皮功能或需要在那些方面對(duì)其進(jìn)行干預(yù)使其成

2、為合格的種子細(xì)胞。
　　 方法：
　　 1．利用0.1％膠原酶消化、分離臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，體外原代培養(yǎng)。0.25％胰酶和0.02％EDTA消化液消化傳代。根據(jù)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的生物學(xué)特征進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色及細(xì)胞對(duì)乙酰化LDL高攝取試驗(yàn)，對(duì)該細(xì)胞鑒定。
　　 2．將HUVEC分成5組，其中一組為新鮮組，其余4組用含10％DMSO、20％胎牛血清的MCDB131凍存液梯度降溫凍存，于4周、8周、12周、24周

3、不同時(shí)間段復(fù)蘇細(xì)胞(37℃水浴快速?gòu)?fù)蘇)，各組培養(yǎng)24小時(shí)后取細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子NO、ET-1、PGE1、vWF，繪制不同凍存時(shí)間細(xì)胞分泌細(xì)胞因子圖。
　　 3．將HUVEC分成5組，其中一組為新鮮組，其余4組應(yīng)用程序降溫法分別深低溫凍存4周、8周、12周、24周，并按規(guī)定凍存時(shí)間復(fù)蘇。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面ICAM-1的變化，并與新鮮組比較。
　　 4．深低溫凍存4周、8周、12周、24周對(duì)HUVEC血

4、管形成能力的影響。不同實(shí)驗(yàn)組在三維基質(zhì)膠中培養(yǎng)4-18小時(shí)后觀察管道生成情況，包括管道的長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)數(shù)等。
　　 結(jié)果：
　　 1．體外原代培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈典型的鋪路石樣形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，細(xì)胞免疫組化顯示Ⅷ因子、CD31、CD34均呈陽(yáng)性反應(yīng)，Dil-Ac-LDL攝取熒光檢測(cè)提示其具有強(qiáng)攝取能力，具有典型血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特征。
　　 2．新鮮組二代HUVEC內(nèi)皮素-1(ET-1)、前列腺素1(

5、PGE1)、血管性血友病因子(vWF)、一氧化氮(NO)平均表達(dá)量各為125.65±14.87pg/ml、520.67±57.32ng/L、427.46±38.95U/L、112.23±17.98umol/L。經(jīng)過(guò)深低溫凍存4周復(fù)蘇后細(xì)胞ET-1、PGE1、vWF、NO平均表達(dá)量各為133.24±16.76pg/ml、503.86±66.43ng/L、453.25±51.32U/L、107.16±20.87umol/L;經(jīng)過(guò)深低溫凍存8

6、周復(fù)蘇后細(xì)胞ET-1、PGE1、vWF、NO平均表達(dá)量各為126.76±22.24pg/ml、502.36±80.67ng/L、444.02±52.87U/L、102.08±25.76umol/L;經(jīng)過(guò)深低溫凍存12周復(fù)蘇后細(xì)胞ET-1、PGE1、vWF、NO平均表達(dá)量各為121.64±23.68pg/ml、436.84±82.81ng/L、418.95±65.32U/L、82.16±9.15umol/L;經(jīng)過(guò)深低溫凍存24周復(fù)蘇后細(xì)胞

7、ET-1、PGE1、vWF、NO平均表達(dá)量各為88.98±25.43pg/ml、408.50±96.69ng/L、365.25±57.92U/L、76.19±10.72umol/L。ET-1各組之間相比較，新鮮組與凍存4周、8周、12周相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，和凍存24周比較開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)；PGE1各組之間相比較，新鮮組與凍存4周、8周相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，和凍存12周、24周比較出現(xiàn)顯著差異(P

8、＜0.05)。vWF各組之間相比較，新鮮組與凍存4周、8周、12周相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，和凍存24周比較開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)；NO各組之間相比較，新鮮組與凍存4周、8周相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，和凍存12周、24周比較出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)。
　　 3.流式檢測(cè)HUVEC細(xì)胞表面細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)，新鮮組、凍存4周、8周、12周、24周ICAM-1表達(dá)率分別81.26±

9、5.36％、91.88±4.36％、91.42±5.81％、92.00±2.50％、93.37±4.87％，新鮮組與凍存各組比較，均有顯著差異(P＜0.05)。凍存各組間相互比較均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.內(nèi)皮細(xì)胞在三維基質(zhì)膠中生長(zhǎng)，有潛在生成血管管腔的能力，通過(guò)在基質(zhì)膠中接種新鮮組及凍存不同時(shí)間組內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)觀察深低溫凍存不同時(shí)限對(duì)HUVEC血管形成能力影響，發(fā)現(xiàn)新鮮組管道生成情況（包括管道的長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)數(shù)等）最好，

10、隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形成管腔的能力逐漸減弱，在凍存24周的內(nèi)皮細(xì)胞在相同實(shí)驗(yàn)條件下基本不能形成完整的管腔結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論：
　　 1．本研究是微小血管移植基礎(chǔ)及臨床研究課題的一部分，建立了一套完整的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞原代分離、培養(yǎng)、及鑒定方法，程序性降溫后深低溫凍存大量細(xì)胞方法，可以初步構(gòu)建臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞庫(kù)，作為組織工程血管內(nèi)皮細(xì)胞的種子細(xì)胞。
　　 2．本研究發(fā)現(xiàn)在短時(shí)間的深低溫凍存環(huán)境下，內(nèi)皮細(xì)胞

11、在形態(tài)，生長(zhǎng)及分泌抗凝，舒張因子等功能狀態(tài)也相似，無(wú)顯著差異。但隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，在超過(guò)3個(gè)月組的研究中PGE1、NO細(xì)胞因子的表達(dá)和新鮮組比較出現(xiàn)了顯著的減弱，在凍存6個(gè)月組的研究中發(fā)現(xiàn)選取的ET-1、PGE1、vWF、N04個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)均較新鮮組出現(xiàn)了顯著減弱。
　　 3．在本實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn)ICAM-1的表達(dá)率和深低溫凍存這個(gè)刺激因素有關(guān)，而和深低溫凍存的時(shí)間無(wú)明顯關(guān)系。
　　 4．內(nèi)皮細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下有構(gòu)