牛角膜內(nèi)皮細胞玻璃化冷凍保護劑及組織低溫斷裂消除方法的研究.pdf

1、深低溫保存是實現(xiàn)角膜長期保存的最有效方法。角膜的慢速凍存法和冷凍干燥法本身存在著很多問題，這使得玻璃化法保存角膜成為一種重要的途徑。 在玻璃化法保存中，冷凍保護劑能夠促進冷凍體系向玻璃態(tài)的轉(zhuǎn)變，減少對細胞或組織的低溫損傷。由保護劑和載體溶液構(gòu)成的玻璃化溶液是組織玻璃化法保存的研究熱點之一。然而，對于不同的細胞或組織，同一種保護劑會顯示出不同程度的毒性及滲透能力，使得最終的保護效果也有所不同。到目前為止，保護劑對細胞或組織的作用機

2、理還不清楚。在為一種既定的細胞類型選擇保護劑時，很大程度上依賴于實驗的方法。 內(nèi)皮細胞是角膜組織中最重要的細胞類型。本論文首先以牛角膜內(nèi)皮細胞為保存對象，篩選合適的保護劑和玻璃化溶液。首先，系統(tǒng)地研究了滲透性保護劑，在考察其玻璃化能力和毒性的基礎上，以冷凍保存的效果為判斷標準，獲得了一種較好的滲透性保護劑組分。然后，分別研究了糖類非滲透性保護劑和大分子非滲透性保護劑。同樣以冷凍保存的效果為判斷標準，在確定保存效果較好的糖和大分子

3、的種類后，確定各自的最優(yōu)濃度。本論文中，滲透性保護劑的篩選范圍包括二甲基亞砜、乙二醇(EG)、1，2-丙二醇、2，3-丁二醇、乙酰胺和乙二醇單甲醚：糖類非滲透性保護劑包括木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖；大分子則包括聚蔗糖(MW7，000)、葡聚糖(MW7，OOO)、硫酸軟骨素(CS，MW18，000～30，000)、牛血清白蛋白(MW68，000)和聚乙二醇(MW6，000、10，000和20，000)。細胞活性評估的

4、主要方法為臺盼蘭拒染法。通過實驗測定和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙二醇、葡萄糖和硫酸軟骨素的保護效果最好。由此獲得的玻璃化溶液的組成是：載體溶液-乙二醇-葡萄糖-硫酸軟骨素，其中，乙二醇、葡萄糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量百分比濃度分別為52％、8％和3％。冷凍保存后角膜內(nèi)皮細胞的活率高達89.4+2.1％，并且繼續(xù)培養(yǎng)后細胞的活力能夠得到恢復。 在組織的玻璃化法保存中，通常采用一步降溫的方式，即將凍存對象直接投入液氮。這種降溫方式的降溫速率較快，

5、會在組織內(nèi)引起較大的熱應力。當熱應力超越組織的承受極限，組織就會發(fā)生低溫斷裂。斷裂會影響組織的保存效果，而且有斷裂存在的組織是絕不允許用于臨床的。 本論文提出了兩步降溫即首先在冷氮氣中降溫然后再轉(zhuǎn)移至液氮的冷凍方法。兩步降溫方法的降溫速率較一步法降溫要低，有利于削弱凍存組織內(nèi)的熱應力進而消除組織的斷裂。本章首先研究了兩步降溫及復溫過程中玻璃化溶液的斷裂情況，并且確定了兩步降溫法的操作參數(shù)；然后分別以肉眼、光學顯微鏡及掃描電子顯微

6、鏡考察了復蘇后組織的斷裂情況。結(jié)果表明，在兩步降溫的過程中，僅在純玻璃化溶液的表面區(qū)域有宏觀斷裂，在溶液的主體部分沒有斷裂發(fā)生。也就是說，兩步降溫法能夠消除玻璃化溶液主體部分的宏觀斷裂。在執(zhí)行兩步降溫時，首先在降溫的第一步，應將凍存對象置于氮氣中-196～-135℃的溫度區(qū)間內(nèi)，在-80℃以上溫度的降溫速率應大于10℃/min；當其溫度降到-100℃以下，即可將凍存對象浸入液氮，降溫速率應小于165℃/min。在經(jīng)歷兩步降溫冷凍后的牛角

7、膜、牛血管和豬的軟骨組織上找不到任何宏觀和微觀的裂紋。本方法不需要大型設備，操作簡便，適合于大規(guī)模推廣使用。 組織的玻璃化法保存中，玻璃化溶液的導入和導出方案極大地影響著保存的效果。合適的方案有利于減弱對細胞的毒性損傷和滲透損傷。對于分步法導入和導出保護劑，保護劑與細胞的平衡時間是導入和導出方案中的重要因素。本論文以正交實驗的方法確定分步導入和導出保護劑過程的平衡時間。結(jié)果表明：導入過程中，與10％EG、25％EG、50％EG和

8、52％EG-8％Glucose-3％CS的最佳平衡時間分別為4min、5min、6min和3min；導出過程中，與50％EG-5％glucose.25％EG-5％glucose、10％EG-5％glucose和5％glucose的最佳平衡時間分別為4min、6min、6min和6min。 最后，論文應用篩選獲得的玻璃化溶液和最佳的平衡時間以及兩步降溫方法保存牛角膜，發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮細胞的活率為41.0±5.9％，顯著高于目前文獻報道