轉基因內皮細胞修飾血管內支架的實驗研究.pdf

1、冠狀動脈內植入支架已成為治療冠心病的重要手段。然而,支架植入不能抑制新生內膜增生,支架內再狹窄(In-stent restenosis, ISR)的發(fā)生率仍有(13-20)％。目前,防治支架內再狹窄的研究熱點在于藥物洗脫性支架,而該支架植入后出現的一些問題已引起廣泛關注:如晚期支架血栓形成,支架涂層材料的不良病理作用,內皮化延遲、動脈瘤、支架貼壁不全等。促進損傷血管愈合、加速支架完全再內皮化過程是解決問題的一條有效途徑。因此,內皮細胞(

2、Endothelial Cell, EC)在再狹窄形成過程中的作用越來越受到重視。內皮細胞移植能替代、修復受損內皮的功能并抑制內膜過度增生。體外培養(yǎng)的內皮細胞由于生長環(huán)境的改變,導致生長緩慢和其他生物特性的丟失,結合基因治療,有望通過對體外培養(yǎng)的內皮細胞穩(wěn)定轉染生長因子,提升細胞的增殖能力;結合動態(tài)培養(yǎng),有望促進內皮細胞在血管內支架表面的粘附和生長;結合模擬體內循環(huán)系統(tǒng)實驗,有望控制細胞支架在輸送過程中的損耗,保障動物實驗結果的真實可靠

3、性。本研究就是基于上述思路開展的應用基礎研究,即轉基因內皮細胞支架的初期研究。在本課題研究研究中,采用陽離子脂質體DOTAP對傳代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞穩(wěn)定轉染血管內皮生長因子VEGF121;并以此轉基因內皮細胞為研究對象,設計并制作了用于血管內支架表面種植細胞的旋轉培養(yǎng)裝置,通過對旋轉速度、旋轉時間、細胞種植密度和重復旋轉的次數這些影響因素的分析,尋找出了粘附效果最好的條件組合;用超聲霧化噴涂法方法制備用于細胞粘附的蛋白涂層,并用掃描

4、電鏡和能譜測試儀檢測制備好的蛋白涂層;根據得到的最佳旋轉培養(yǎng)條件制備轉基因內皮細胞包被支架,通過掃描電鏡檢測,旋轉培養(yǎng)后血管內支架表面粘附的細胞數量和鋪展情況,免疫熒光檢測支架表面粘附的細胞表達VEGF蛋白的情況;體外流動腔實驗檢測經過傳輸的損耗和流動剪切力的作用后,轉基因內皮細胞在血管內支架表面的粘附和生長情況;最后通過兔腹主動脈支架植入術的動物模型檢測轉基因內皮細胞包被支架的在體抗再狹窄和抗血栓的效果。研究結果如下:1)通過RT-P

5、CR和免疫細胞化學鑒定,成功建立轉VEGF基因人臍靜脈內皮細胞系;2)通過對旋轉速度、旋轉時間、細胞種植密度和重復旋轉的次數這些影響因素的分析,尋找出了粘附效果最好的條件組合,當細胞種植密度為1×105cells/ml,旋轉時間為6h,旋轉速度為0.4rpm時,旋轉培養(yǎng)粘附的細胞數量最多;3)制備明膠濃度為2-6mg/ml,多聚賴氨酸為10μg/ml的混合溶液,用超聲霧化噴涂法方法得到的蛋白涂層經檢測在支架表面涂覆緊密、均勻;4)通過優(yōu)

6、化的旋轉培養(yǎng)條件制備出轉基因內皮細胞覆蓋的血管內支架,在光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察,細胞在支架表面粘附生長,熒光顯微鏡檢測細胞高表達VEGF蛋白;5)體外流動腔實驗檢測發(fā)現,轉基因內皮細胞在模擬體內傳輸過程中,將有部分細胞損失,但是在不同的切應力作用下,轉基因內皮細胞又很快的恢復生長;6)動物實驗結果發(fā)現與兩個對照組相比,細胞包被支架均極顯著的抑制了內膜增生和降低了支架內再狹窄。綜上所述,本研究初步解決了血管內支架的細胞種植方法,提出一