VEGF及EPCs結(jié)合膠促進(jìn)大鼠梗死心肌血管再生的可行性研究.pdf

1、目的：通過相應(yīng)的組織工程方法使得心梗后心肌血管再生。本研究包括：1,研究內(nèi)皮細(xì)胞生長因子通過纖維蛋白膠釋放到心肌從而刺激心肌血管的再生的可能性并觀察心功能改善情況；2, 通過可降解材料纖維蛋白膠將內(nèi)皮祖細(xì)胞移植到大鼠心肌觀察心肌血管再生情況和心功能改善情況。
　　 方法：1,本課題第一部分選擇了28只9周齡SD大鼠，其中13只進(jìn)行了左前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)導(dǎo)致左室急性心肌梗死為心梗組，15只大鼠未行結(jié)扎術(shù)為非心梗組。首先制作纖維

2、蛋白膠以及構(gòu)成重組體α2-PI1–8-VEGF121，然后使二者結(jié)合構(gòu)成VEGF結(jié)合膠用于移植。將7只心梗大鼠和6只非心梗大鼠心臟移植了VEGF結(jié)合膠；作為對照對6只心梗大鼠和6只非心梗大鼠移植了空白的纖維蛋白膠；另外3只為正常大鼠未作任何處理來作為組織學(xué)對照。在心梗大鼠中，移植在心梗后即刻進(jìn)行。所有大鼠保存4周，處死前行心功能的超聲檢查。處死后對大鼠心肌進(jìn)行組織學(xué)與免疫組織化學(xué)研究，即行CD31抗體染色和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體染色（S

3、MA）來探測血管。對非心梗心臟，首先定義兩個(gè)區(qū)域，即膠下和間隔區(qū)（遠(yuǎn)離膠）；而對心梗心臟定義為缺血區(qū)和間隔區(qū)。每個(gè)區(qū)域在放大200倍條件下各采3張相片，每張共6張相片。應(yīng)用生物通用分析處理軟件做定量的血管形態(tài)分析（為盲法）。通過3個(gè)參數(shù)來測量血管，即：①總的血管密度（在總的組織中的血管數(shù)量/mm2）；②總的血管數(shù)在心肌區(qū)域中的比例（心肌區(qū)域中的總血管數(shù)量/mm2）；③總血管區(qū)的百分比（總組織中血管區(qū)域的百分比）?？偟慕M織部分要去除白色空

4、白區(qū)域來除外因不同原因所致的空白區(qū)域（如切片制作過程中的破口等）所造成的偏倚,然后從總組織區(qū)域中去除血管區(qū)域來確定心肌區(qū)域。生物通用處理軟件直接將血管分成3組，即：毛細(xì)血管組（血管直徑＜10μm）；微血管組（10μm≤血管直徑≤20μm）；大血管組（血管直徑＞20μm）。動(dòng)脈數(shù)量通過肉眼確定，即將組織切片放大100倍條件下通過肉眼對其組織學(xué)特性的標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)別計(jì)數(shù)動(dòng)脈數(shù)量。檢測整個(gè)左室的動(dòng)脈，動(dòng)脈密度以每平方毫米總組織區(qū)域中動(dòng)脈血管的數(shù)量來

5、表達(dá)；2,第二部分選擇了27只9周齡SD大鼠，體重300～350g。其中18只進(jìn)行了左前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)導(dǎo)致左室急性心肌梗死，其余9只未行結(jié)扎術(shù)。首先制作纖維蛋白膠以及從人臍帶血中用磁珠法分離內(nèi)皮祖細(xì)胞，然后將內(nèi)皮祖細(xì)胞種植于纖維蛋白膠構(gòu)成載有內(nèi)皮祖細(xì)胞的纖維蛋白材料用于移植。將大鼠分為3個(gè)組：第一組為9只無心梗大鼠；第二組為9只心梗后立即進(jìn)行移植的大鼠；第三組為9只心梗后1周進(jìn)行移植的大鼠。每個(gè)組在移植后3周或8周處死。為了抑制大

6、鼠對EPCs膠的免疫排斥反應(yīng)本研究使用了微量滲透泵持續(xù)給予環(huán)保菌素A。大鼠處死前行經(jīng)胸腔超聲心動(dòng)圖檢查以測定左室功能。處死后行組織學(xué)與免疫組織化學(xué)研究，即經(jīng)股靜脈注射15%KCI 2毫升處死大鼠使大鼠心跳停止在舒張期，取心臟進(jìn)行福爾馬林固定，蠟塊包埋后做成3μm組織切片，行蘇木精-伊紅（HE）和免疫組化染色, 人CD34抗體和Tra-1-85抗體染色來探測移植的人類細(xì)胞。心臟血管測量的方法與VEGF相同，應(yīng)用同樣的采樣方法。即3個(gè)CD3

7、4抗體染色切片，用同樣的方法在每個(gè)切片選擇1個(gè)區(qū)域（非心梗心臟在膠下，心梗心臟在缺血區(qū)），且每個(gè)區(qū)域取6張相片。計(jì)算機(jī)評估血管的形態(tài)同第一部分。
　　 結(jié)論：1,VEGF纖維蛋白膠可以通過增加心梗和非心梗的毛細(xì)血管而促進(jìn)血管生成，并且在梗死周圍缺血區(qū)域更有意義?？梢酝ㄟ^控制并維持低劑量的釋放VEGF來預(yù)防血管結(jié)構(gòu)的異常。移植VEGF膠的心梗大鼠的心功能較使用空白膠組有好轉(zhuǎn)的趨勢，但為顯示有意義的結(jié)果需要更多數(shù)量的大鼠；2, 盡管