新信號(hào)分子SH2D4A調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、SH2D4A是本實(shí)驗(yàn)室利用外顯子捕獲技術(shù)在人染色體疾病基因富含區(qū)域8p22克隆得到的只具有單一SH2結(jié)構(gòu)域的SH2信號(hào)蛋白家族的新成員[1]。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)SH2D4A亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)，并在許多組織中表達(dá)[2]。由100個(gè)氨基酸組成的SH2結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用，能特異性識(shí)別并結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基[3]，參與和酪氨酸激酶相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。具有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)大部分是含有多種結(jié)構(gòu)域的酶類信號(hào)蛋白或接頭蛋白，在信號(hào)

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中除了介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用，還調(diào)節(jié)相關(guān)的催化亞單位。我們克隆的SH2D4A具有典型的SH2結(jié)構(gòu)域，提示其可能與酪氨酸激酶型受體結(jié)合，在酪氨酸激酶的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用，但除SH2結(jié)構(gòu)域外SH2D4A不具有其它結(jié)構(gòu)域，提示它可能具有不同于其他SH2信號(hào)蛋白的生物學(xué)功能。迄今為止尚無(wú)有關(guān)SH2D4A生物學(xué)功能的詳細(xì)報(bào)道。 本研究中我們構(gòu)建了野生型和缺陷型SH2D4A表達(dá)載體，通過(guò)MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SH2D4A對(duì)細(xì)

3、胞增殖和凋亡的影響。由于胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ(IGFⅡ)可以通過(guò)典型的酪氨酸激酶型受體—胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ受體(IGFⅠ R)促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡[4]，因此我們檢測(cè)了IGFⅡ刺激下SH2D4A對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響；同時(shí)檢測(cè)了與細(xì)胞增殖和凋亡都相關(guān)的信號(hào)激酶—蛋白激酶C(PKC)以及可以激活PKC的第二信使—Ca2+，分析SH2D4A影響細(xì)胞增殖和凋亡的可能機(jī)制。 為發(fā)現(xiàn)與SH2D4A相互作用的上游受體蛋白，我們以SH2D4

4、A為誘餌蛋白應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選腎臟cDNA文庫(kù)，篩選發(fā)現(xiàn)雌激素受體α亞型(Erα)能夠與SH2D4A相互作用，并通過(guò)酵母雙雜交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、GST pull—down三種不同方法驗(yàn)證了SH2D4A與Erα間的相互作用。 由于有報(bào)道與SH2D4A結(jié)構(gòu)極為相似的SH2信號(hào)家族成員—SH2結(jié)構(gòu)域蛋白1A(SH2D1A)在淋巴細(xì)胞信號(hào)激活分子(SLAM)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮抑制作用，調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞間的協(xié)同作用[5，6]，以及

5、免疫細(xì)胞的增殖與凋亡；因此我們推測(cè)SH2D4A可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮相似的抑制作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡，并檢測(cè)SH2D4A對(duì)Erα介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響。我們發(fā)現(xiàn)磷脂酶Cγ亞型(PLC—γ)與Erα間存在相互作用，并通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和PKC活性的檢測(cè)，揭示SH2D4A對(duì)雌激素(E2)/Erα介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)的影響和產(chǎn)生此影響的分子機(jī)制。SH2D4A對(duì)E2/Erα誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用提示SH2D4A可能應(yīng)用于Ers相關(guān)腫瘤的

6、治療。以上研究結(jié)果為深入探討SH2D4A的生物學(xué)特性和開(kāi)發(fā)其應(yīng)用價(jià)值奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、人胚腎細(xì)胞系HEK293 2、構(gòu)建表達(dá)載體相關(guān)試劑 3、MTT檢測(cè)相關(guān)試劑 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相關(guān)試劑 5、PKC活性熒光檢測(cè)試劑盒 6、Fluo—3AM熒光染料 7、Western印跡雜交相關(guān)試劑 8、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑 9、免

7、疫共沉淀(IP)相關(guān)試劑 10、GST pull—down相關(guān)試劑 11、常用實(shí)驗(yàn)設(shè)備如熒光分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、自動(dòng)凝膠成像分析儀、全溫振蕩培養(yǎng)箱等。 12、常用數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件如基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(kù)、凝膠成像及掃描分析軟件、引物設(shè)計(jì)軟件(Primer3)、SPSS version13.0等。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建缺失SH2結(jié)構(gòu)域的缺陷型S

8、H2D4A表達(dá)載體pSH2D4A—Delet，檢測(cè)SH2結(jié)構(gòu)域在SH2D4A中的作用。 2、通過(guò)MTT方法繪制生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)SH2D4A對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)單染和雙染技術(shù)檢測(cè)SH2D4A對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 4、應(yīng)用PepTag熒光試劑盒檢測(cè)SH2D4A對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C(PKC)活性的影響，及IGFⅡ和E2刺激下SH2D4A對(duì)胞內(nèi)PKC活性的調(diào)節(jié)。 5、應(yīng)用Fluo—

9、3AM熒光染料檢測(cè)SH2D4A對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)的影響，及IGFⅡ和E2刺激下SH2D4A對(duì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)。 6、構(gòu)建pAD/Erα表達(dá)載體；應(yīng)用酵母雙雜交篩選和檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)和證明酵母細(xì)胞中SH2D4A與Erα的相互作用。 7、通過(guò)酶切、連接和轉(zhuǎn)化等技術(shù)構(gòu)建含有HA標(biāo)簽的野生型SH2D4A表達(dá)載體pSH2D4A—HA；應(yīng)用免疫共沉淀方法，分別利用HA、Erα或磷脂酶C—γ(PLC—γ)抗體進(jìn)

10、行免疫沉淀，并使用相應(yīng)抗體為一抗進(jìn)行Western印跡雜交，分別檢測(cè)SH2D4A與Erα，PLC—γ與Erα的相互作用，及SH2D4A對(duì)PLC—γ與Erα相互作用的影響。 8、構(gòu)建pGST/SH2D4A及pGST/Erα表達(dá)載體；應(yīng)用GST pull—down技術(shù)在體外雙向鑒定SH2D4A與Erα間的相互作用。 結(jié)果： 1、構(gòu)建缺陷型SH2D4A表達(dá)載體、pAD/Erα表達(dá)載體、pSH2D4A—HA表達(dá)載體、pG

11、ST/SH2D4A和pGST/Erα表達(dá)載體，為深入研究SH2D4A的生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。 2、通過(guò)MTT和流式細(xì)胞術(shù)單染和雙染技術(shù)檢測(cè)到SH2D4A抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且SH2D4A對(duì)IGFⅡ的促增殖和抗凋亡作用都有抑制作用，但SH2D4A只能抑制E2的促增殖作用，而對(duì)E2的抗凋亡作用沒(méi)有影響。 3、應(yīng)用PepTag試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKC活性發(fā)現(xiàn)SH2D4A能夠抑制PKC的激活，并能夠阻止IGFⅡ和E2激活胞

12、內(nèi)PKC。 4、通過(guò)熒光染料檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，發(fā)現(xiàn)SH2D4A能夠抑制IGFⅡ和E2上調(diào)Ca2+濃度。 5、酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)Era可能與SH2D4A相互作用，酵母雙雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SH2D4A與Erα間的相互作用。 6、轉(zhuǎn)染細(xì)胞后提蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SH2D4A與Erα間存在相互作用。 7、誘導(dǎo)、純化融合蛋白GST—SH2D4A和GST—Erα，GST pull—down實(shí)驗(yàn)結(jié)

13、果證明SH2D4A與Erα的相互作用是直接的，不借助于真核細(xì)胞中的其他任何蛋白。 8、通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PLC—γ能夠與Erα結(jié)合，且SH2D4A能夠與PLC—γ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于Erα。 結(jié)論： 1、SH2D4A通過(guò)影響PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 2、SH2D4A與Erα及PLC—γ與Erα之間存在相互作用，而SH2D4A與PLC—γ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Erα，通過(guò)Erα/PLC—γ/PKC信號(hào)通路