Hoxa5對脂肪細胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用及其分子機制研究.pdf

1、細胞的增殖與凋亡是生物體生長和發(fā)育的重要基礎。脂肪組織的發(fā)育與沉積包括兩個不同的過程:脂肪細胞數(shù)目增多和體積增大。而脂肪過度沉積會造成一種非健康狀態(tài)，除了由于能量代謝的紊亂，還要歸因于脂肪細胞正常增殖和凋亡程序受損。Hoxa5作為Hox家族重要成員之一，其編碼蛋白是與發(fā)育相關的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)Hox家族成員調(diào)節(jié)人體白色與棕色脂肪發(fā)育，并且在身體不同部位脂肪組織中的表達有很大差異;Hoxa5的甲基化水平調(diào)節(jié)著小鼠不同部位脂肪細胞的分

2、化。所以，本研究推測Hoxa5也有可能參與調(diào)控脂肪細胞的增殖與凋亡。然而，近年來關于Hoxa5的研究主要集中在癌細胞上，關于其對脂肪細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)機制還不清楚。本研究中，在脂肪細胞中超表達或干擾Hoxa5，運用CCK-8、EdU染色、Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI染色、TUNEL染色、JC-1染色、流式細胞術、棕櫚酸和血清饑餓誘導的細胞凋亡模型、RT-PCR和Western Blot、雙熒光素酶報告系統(tǒng)等方法

3、和技術，系統(tǒng)研究了Hoxa5在脂肪細胞增殖與凋亡過程中的調(diào)節(jié)作用，獲得的主要研究結果如下:
　　1.Hoxa5通過增加細胞周期阻滯抑制脂肪細胞增殖
　　細胞計數(shù)結果顯示，超表達Hoxa5顯著減少增殖過程中脂肪細胞數(shù)量(P＜0.05)。細胞周期檢測結果顯示，超表達組中G0/G1期的細胞所占比例顯著升高，而S期細胞比例顯著下降，同時復制期中核內(nèi)DNA含量也明顯減少(P＜0.05);RT-PCR和Western Blot結果顯示，

4、超表達Hoxa5抑制促增殖相關基因PCNA、Cyclin E、CyclinD的表達，促進細胞周期抑制因子p27、p53的表達(P＜0.05)，干擾Hoxa5同以上結果呈相反趨勢。說明Hoxa5增加周期阻滯進而抑制脂肪細胞增殖。深入研究發(fā)現(xiàn)超表達Hoxa5顯著降低JAK2/STAT3信號通路中關鍵因子JAK2、STAT3的磷酸化水平，并伴隨著周期蛋白Cyclin E表達下調(diào)，周期抑制蛋白p53表達上調(diào)(P＜0.05)，說明Hoxa5通過抑

5、制JAK2/STAT3通路增加細胞周期阻滯。
　　2.Hoxa5通過線粒體途徑促進脂肪細胞凋亡
　　Hoxa5顯著增加了凋亡細胞的數(shù)量，顯著促進了脂肪細胞早期和晚期凋亡的發(fā)生，加劇了基因組DNA的片段化程度(P＜0.01)。JC-1熒光探針法結合流式細胞術檢測結果顯示，超表達Hoxa5顯著降低線粒體膜電位，顯著提升了Cyt-c的蛋白表達(P＜0.05);RT-PCR和Western Blot結果顯示，超表達Hoxa5顯著上調(diào)

6、線粒體途徑促凋亡基因Bax、Bid、Bad表達，顯著下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2表達，增加了Caspase-9、Caspase-3的切割活性(P＜0.05)，干擾Hoxa5同以上結果呈相反趨勢。綜上結果說明，Hoxa5促進脂肪細胞凋亡，并且主要通過線粒體途徑。利用棕櫚酸和血清饑餓誘導的細胞凋亡模型進一步驗證發(fā)現(xiàn)，Hoxa5加劇了模型下脂肪細胞凋亡的程度。另外，深入研究發(fā)現(xiàn)，在Hoxa5調(diào)節(jié)細胞凋亡的線粒體途徑中Akt/mTORC1/S6K1

7、通路也參與其中。
　　3.Hoxa5通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)脂肪細胞增殖與凋亡
　　利用生物信息學手段對增殖和凋亡相關基因啟動子上的Hoxa5轉(zhuǎn)錄結合位點進行了預測，發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)周期蛋白的基因中，Ccne1啟動子區(qū)域有Hoxa5的轉(zhuǎn)錄結合位點;在線粒體途徑凋亡相關基因中，Bax啟動子區(qū)域有Hoxa5的轉(zhuǎn)錄結合位點。根據(jù)預測結果，構建雙熒光素酶報告系統(tǒng)，檢測發(fā)現(xiàn)，Hoxa5負轉(zhuǎn)錄調(diào)控Ccne1，正轉(zhuǎn)錄調(diào)控Bax，進一步證明了Hoxa5通