HOXA5對體外及體內(nèi)培養(yǎng)的器官樣表皮增殖、分化、分層的調(diào)控研究.pdf

1、同源異形框基因(HOX genes)對成體表皮的更新具有重要調(diào)控作用,其調(diào)控機制模擬了胚胎發(fā)育模式。其中HOXA5就是一個重要的發(fā)育調(diào)控因子。然而關(guān)于HOXA5在皮膚生理學(xué)中的作用究竟是促進增殖還是抑制增殖,至今仍存在著爭議。
　　目的:本課題通過角質(zhì)形成細胞基因轉(zhuǎn)染和器官樣表皮構(gòu)建的方法,明確HOXA5對表皮細胞增殖和表皮生長的調(diào)控作用。
　　方法:(1)構(gòu)建野生型HOXA5和同源結(jié)構(gòu)域缺失的突變型HOXA5的慢病毒載體,

2、將其轉(zhuǎn)染人永生化角質(zhì)形成細胞系HaCaT。通過cck-8增殖試驗和流式分析,觀察兩者對細胞增殖和細胞周期的影響。并用Annexin V檢測各轉(zhuǎn)染細胞株的凋亡情況。(2)將各轉(zhuǎn)染細胞株氣液培養(yǎng)2周,形成三維表皮結(jié)構(gòu)。HE染色觀察其組織形態(tài)。PCNA和TUNEL染色了解表皮細胞增殖和凋亡情況。免疫熒光染色檢測分化標(biāo)記物keratin5、keratin10、involucrin、filaggrin表達,觀察HOXA5及其突變體對器官樣表皮形成

3、和分化的影響。(3)將器官樣表皮移植入裸鼠體內(nèi),每周取材,連續(xù)四周,觀察各移植物組織形態(tài)學(xué)的動態(tài)變化并檢測表皮分子標(biāo)記物表達。
　　結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染了野生型HOXA5的HaCaT、細胞增殖速率降低,G1期細胞比例顯著增加,G1-S期進程受阻滯,細胞早期和晚期凋亡率明顯升高。而轉(zhuǎn)染了突變型HOXA5的HaCaT細胞則呈現(xiàn)相反表現(xiàn)。(2)野生型HOXA5構(gòu)建的器官樣表皮形態(tài)紊亂,有大量空泡形成,角化層缺失,細胞失去極性,類似于細胞因子

4、缺失的表皮形態(tài)。同時PCNA陽性細胞比例減少,凋亡細胞比例上升。表皮基底層標(biāo)記物Keratin5表達缺失,但基底層上分化相關(guān)的keratin10、involucrin、filaggrin表達略有增強。而突變型HOXA5構(gòu)建的器官樣表皮形態(tài)良好,PCNA陽性細胞率增加且凋亡細胞率減少,各分子標(biāo)記物表達正常。(3)體內(nèi)移植后,由于完善的旁分泌系統(tǒng)作用,野生型HOXA5移植物部分恢復(fù)了正常表皮結(jié)構(gòu),keratin5也重新表達于基底層,但與對照