新維A酸化合物ECPIRM對皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞HUT78增殖、凋亡和免疫調(diào)節(jié)作用及分子機制研究.pdf

1、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)是一組異質(zhì)性的T淋巴細(xì)胞來源的非霍奇金淋巴瘤，蕈樣肉芽腫(MF)和Sezary Syndome綜合征(SZS)是其最常見的兩種類型。
　　第一部分 ECPIRM對CTCL細(xì)胞HUT78增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響及作用機制研究
　　目的:觀察新維A酸化合物ECPIRM對CTCL細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期生物學(xué)效應(yīng)，并探討其作用機制，為ECPIRM的成藥性提供依據(jù)。
　　1、ECPIRM對CTC

2、L細(xì)胞增殖的影響
　　方法:用MTT法、臺盼藍(lán)拒染法檢測濃度為5μM、10μM、20μM和40μM的ECPIRM分別作用HUT78細(xì)胞、Myla細(xì)胞（初始濃度:3.5×104）及正常人淋巴細(xì)胞（初始濃度:5.0×104）24h、48h、72h及96h后對其增殖的影響。
　　結(jié)果:(1)ECPIRM明顯抑制HUT78細(xì)胞增殖活性:
　　實驗顯示40μM的ECPIRM作用24h后，HUT78細(xì)胞增殖被明顯抑制，作用48h后

3、，10μM及以上濃度ECPIRM明顯抑制HUT78細(xì)胞增殖，抑制率在96h達(dá)最高峰(P＜0.01)。
　　(2)ECPIRM明顯抑制Myla細(xì)胞增殖活性:
　　實驗顯示20μM的ECPIRM作用72h后明顯抑制Myla細(xì)胞增殖，40μM的ECPIRM作用后抑制率增加，作用96h后抑制率最大(P＜0.01)。
　　結(jié)論:ECPIRM顯著抑制CTCL細(xì)胞HUT78及Myla的增殖。對正常人淋巴細(xì)胞增殖無明顯影響。
　

4、　2、ECPIRM對CTCL細(xì)胞凋亡的影響
　　方法:(1)利用熒光顯微鏡觀察濃度分別為5μM、10μM和20μM的ECPIRM作用HUT78細(xì)胞24h、48h及72h后，HUT78細(xì)胞的形態(tài)變化。用相同的方法處理HUT78細(xì)胞及正常人淋巴細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinⅤ/PI雙染法)檢測凋亡率。
　　結(jié)果:ECPIRM明顯誘導(dǎo)HUT78細(xì)胞凋亡:
　　顯微鏡觀察ECPIRM作用后HUT78細(xì)胞的形態(tài)變化，與未

5、處理的HUT78細(xì)胞相比，作用24h后，HUT78細(xì)胞形態(tài)無明顯改變;作用48h后，可觀察到ECPIRM處理后的細(xì)胞數(shù)量較未處理細(xì)胞稀疏，有部分凋亡細(xì)胞及細(xì)胞核碎片。
　　結(jié)論:ECPIRM具有明顯促進(jìn)HUT78細(xì)胞凋亡的作用，對正常人淋巴細(xì)胞凋亡無明顯影響。ECPIRM的增殖、凋亡作用通過抑制BCL-xl和c-myc表達(dá)實現(xiàn)。
　　3、ECPIRM對CTCL細(xì)胞細(xì)胞周期的影響
　　方法:利用流式細(xì)胞術(shù)(PI染色)檢測

6、濃度分別為5μM、10μM和20μM的ECPIRM作用HUT78細(xì)胞24h、48h及72h后，HUT78細(xì)胞的周期分布變化。
　　結(jié)果:ECPIRM具有明顯阻滯HUT78細(xì)胞的細(xì)胞周期作用:
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測ECPIRM對HUT78細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。作用24h后，ECPIRM對HUT78細(xì)胞的細(xì)胞周期無影響。
　　結(jié)論:ECPIRM通過影響細(xì)胞周期蛋白使HUT78細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。
　　4、ECPI

7、RM抑制JAK/STAT通路活性
　　方法:用westernblot檢測濃度分別為5μM、10μM和20μM的ECPIRM作用HUT78細(xì)胞72h后，JAK/STAT通路蛋白變化。
　　結(jié)果:通過westernblot檢測JAK/STAT通路蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果表明JAK1、STAT3及STAT5表達(dá)無變化，pJAK1、pSTAT3及pSTAT5表達(dá)量隨ECPIRM劑量增大逐漸下降。
　　結(jié)論:ECPIRM具有抑制JA

8、K/STAT通路活性的作用，推測ECPIRM對HUT78細(xì)胞增殖抑制、促凋亡及周期改變與此相關(guān)。
　　第二部分 ECPIRM對CTCL細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及機制研究
　　目的:探討新維A酸化合物ECPIRM對CTCL細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，并探討其可能的作用機制。
　　1、ECPIRM對CTCL細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的濃度選擇
　　方法:用MTT法檢測濃度分別為0.01μM、0.1μM、1μM和10μM的ECPIRM作用HUT78

9、細(xì)胞（初始濃度5×104）24h、48h、72h及96h后對其增殖的影響
　　結(jié)果:濃度分別為0.01μM、0.1μM及1μM的ECPIRM分別作用24h、48h、72h及96h后均不能明顯抑制HUT78細(xì)胞的增殖，10μM的ECPIRM作用HUT78細(xì)胞48h后明顯抑制HUT78細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:本實驗可選擇0.01μM、0.1μM及1μM的ECPIRM作用HUT78細(xì)胞96h為后續(xù)試驗的條件。
　　2、ECPI

10、RM對CTCL細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的影響
　　方法:用RT-qPCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測濃度分別為0.01μM、0.1μM和1μM的ECPIRM作用HUT78細(xì)胞96h后，對IL-2、IL-12、IFGγ、IL-4、IL-5、IL-10及TGF-β表達(dá)變化
　　結(jié)果:RT-qPCR結(jié)果表明IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-5在HUT78細(xì)胞中表達(dá)量低。ECPIRM可低水平增加IL-2、IL-12及IFN-γ的mRNA水平

11、，明顯降低IL-10及TGF-β的mRNA水平，對IL-4和IL-5無影響。
　　結(jié)論:ECPIRM可通過降低IL-10及TGF-β表達(dá)來調(diào)節(jié)CTCL細(xì)胞的免疫。
　　3、ECPIRM對CTCL細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用機制的初步探討
　　方法:用RT-qPCR及western bolt法檢測濃度分別為0.01μM、0.1μM和1μM的ECPIRM作用HUT78細(xì)胞96h后，對NF-KB通路P65及IkBα的mRNA水平變化及P

12、65、IkBα及pIkBα蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:RT-qPCR結(jié)果顯示1μM的ECPIRM作用后P65及IkBα的mRNA水平明顯下降。
　　結(jié)論:ECPIRM能抑制NF-KB通路活性。NFKB通路活性被抑制是ECPIRM抑制IL-10及TGF-β分泌的機制之一。
　　第三部分 ECPIRM對HUT78細(xì)胞表達(dá)的維A酸受體活性的影響
　　目的:探討ECPIRM對T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)的維A酸受體的影響。

13、　　1、ECPIRM對維A酸類受體及其下游基因mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的影響
　　方法:利用RT-qPCR和western blot分別檢測濃度為0.1μM、1μM和10μM的ECPIRM和ATRA作用HUT78細(xì)胞96h后，其表達(dá)的RAR、RXR及下游基因他扎羅汀誘導(dǎo)基因1(TIGI)，細(xì)胞色素P450家族成員26A1(CYP26A1)和STAT1的mRNA水平及CYP26A1、STAT1及TIGI蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)

14、果:ECPIRM對RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ及其下游基因CYP26A1、TIG1和STAT1蛋白和mRNA均無明顯影響。
　　結(jié)論:在HUT78細(xì)胞中，ECPIRM不激活維A酸受體信號通路。
　　2、比較維A酸受體抑制劑ECPIRM、ATRA及貝扎羅汀單用及聯(lián)合維A酸類受體抑制劑對HUT78細(xì)胞增殖的影響。
　　方法:用MTT法比較單用濃度為0.1μM、1μM和10μM的ECPIRM、ATRA及0

15、.1μM、1μM和10μM的ECPIRM、ATRA聯(lián)合1μM或10μM的AGN193109作用HUT78細(xì)胞24、48、72及96h后，四組藥物對HUT78細(xì)胞的增殖抑制作用，并比較四組藥物作用24h及96h后的IC50。
　　結(jié)果:維A酸RAR拮抗劑(AGN193109)及維A酸RXR拮抗劑（單蒽醌）均不影響ECPIRM對HUT78細(xì)胞的增殖活性;而維A酸RAR拮抗劑(AGN193109)明顯影響維A酸RAR激動劑ATRA對HU

16、T78細(xì)胞的增殖抑制作用;維A酸RXR拮抗劑明顯影響維A酸RXR選擇劑貝扎羅汀對HUT78細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　結(jié)論:ECPIEM對HUT78細(xì)胞增殖的抑制作用均不受維A酸受體抑制劑的影響。進(jìn)一步表明，ECPIRM對HUT78細(xì)胞增值的抑制是非維A酸受體途徑的。
　　小結(jié):
　　1、ECPIRM對CTCL細(xì)胞HUT78具有明確的抑制增殖、促進(jìn)凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用，其對HUT78細(xì)胞增殖抑制作用顯著優(yōu)于ATRA、

17、13-cis RA及貝扎羅汀(p＜0.01)。同時，ECPIRM對正常人淋巴細(xì)胞無明顯抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用。
　　2、ECPIRM具有阻滯CTCL細(xì)胞HUT78于G0/G1期的作用，其機制通過增加p21和p27的蛋白表達(dá)，抑制CyclinD1、CyclinE、CDK2及CDK4的蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化。
　　3、ECPIRM促進(jìn)HUT78細(xì)胞凋亡，發(fā)生G0/G1期的阻滯可能與JAK/STAT通路被抑制有關(guān)。

18、
　　4、ECPIRM具有調(diào)節(jié)惡性T細(xì)胞分泌Th1/Th2細(xì)胞因子的作用，其機制與抑制NF-KB通路活性有關(guān)。
　　5、ECPIRM不影響HUT78細(xì)胞RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ及其下游基因CYP26A1、STAT1、TIGI的表達(dá)，其對HUT78細(xì)胞的抗增殖作用也不受維A酸受體抑制劑的影響。表明ECPIRM對HUT78的生物學(xué)效應(yīng)是非維A酸受體途徑依賴。推測ECPIRM在腫瘤治療中可能具有一定治療學(xué)優(yōu)