G蛋白偶聯(lián)受體激酶5對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)及其機(jī)制研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupledreceptor,GPCR)是種類最多的細(xì)胞表面受體超家族,介導(dǎo)多種多樣的配體信號(hào),包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素、氣味及其它小分子,同時(shí)也介導(dǎo)多種藥物的活性。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupledreceptorkinases,GRKs)是調(diào)節(jié)GPCR的一類關(guān)鍵的絲蘇氨酸激酶。當(dāng)受體被活化后,GRK通過結(jié)合并迅速磷酸化受體胞內(nèi)段,抑制受體的持續(xù)激活,導(dǎo)致受體的脫敏,并在其后發(fā)生的受

2、體內(nèi)吞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。GRK有七種亞型,分為三個(gè)亞家族。其中GRK5廣泛分布于全身多種器官,尤其高表達(dá)于心臟和肺,也廣泛分布于骨骼肌,腦等器官,對(duì)多種GPCR具有選擇性的調(diào)節(jié)作用。GRK起初被認(rèn)為僅僅是GPCR的負(fù)性調(diào)控因子,然而不少證據(jù)表明,一些GRK亞型,尤其是GRK5,可能具有新的功能。GRK5能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)胞漿中多種非受體底物,有特殊的核定位信號(hào)序列(NuclearLocationSequence,NLS),能發(fā)生細(xì)胞

3、核-胞漿的穿梭,并具有結(jié)合和影響轉(zhuǎn)錄因子的能力。此外研究提示GRK5在細(xì)胞周期的控制和細(xì)胞凋亡等重要的生理過程中也具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,然而具體作用途徑和影響方式有待進(jìn)一步的研究。
　　腫瘤抑制因子p53調(diào)節(jié)了一系列重要生理過程,包括DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期阻滯,細(xì)胞增殖,分化和衰老等等。P53蛋白水平的調(diào)節(jié)是影響其作用的重要途徑之一,基礎(chǔ)狀態(tài)下p53主要通過泛素化和蛋白酶體降解途徑維持在較低蛋白水平,p53的磷酸化對(duì)其穩(wěn)

4、定性起著重要的調(diào)節(jié)作用。我們的工作研究了GRK5在DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程中的作用,以及GRK5對(duì)p53的調(diào)控機(jī)制。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
　　1.GKK5能夠結(jié)合并磷酸化p53的55位蘇氨酸,促進(jìn)p53的泛素化-蛋白酶體途徑降解過程。我們用免疫沉淀和體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí),GRK5能夠特異性結(jié)合p53;采用放射性同位素標(biāo)記的體外激酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GRK5能夠磷酸化p53,采用多種p53磷酸化位點(diǎn)特異性的抗體通過Western免疫印跡篩選后發(fā)

5、現(xiàn),GRK5能夠特異性磷酸化p53的55位蘇氨酸。突變?cè)撐稽c(diǎn)為丙氨酸或采用GRK5激酶活性缺失的突變體GRK5K215R,以及使用GRK家族的抑制劑heparin均能有效抑制GRK5對(duì)p53的55位蘇氨酸磷酸化。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,GRK5小干擾RNA(siRNA)處理能夠明顯減弱腫瘤細(xì)胞內(nèi)源的p53的55位蘇氨酸磷酸化并增強(qiáng)內(nèi)源p53蛋白水平;過表達(dá)GRK5則能夠增強(qiáng)53的55位蘇氨酸磷酸化并降低內(nèi)源p53蛋白水平,同時(shí)GRK5激酶活性缺失

6、的突變體無(wú)此作用。我們發(fā)現(xiàn)GRK5siRNA處理并未減弱p53的轉(zhuǎn)錄水平,采用Mdm2siRNA,或藥物處理阻斷p53-Mdm2相互作用,或蛋白酶體抑制劑三種方式阻斷p53的降解途徑之后,GRK5siRNA就不能改變p53的蛋白水平,提示GRK5通過促進(jìn)了p53轉(zhuǎn)錄后的降解過程影響了p53的表達(dá)。并且這一作用是依賴于GRK5激酶活性的,過表達(dá)GRK5的腫瘤細(xì)胞中外轉(zhuǎn)或者內(nèi)源的p53蛋白水平均有降低,而GRK5激酶活性缺失的突變體無(wú)此作用

7、。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),過表達(dá)GRK5促進(jìn)了p53的泛素化和降解,突變p53的55位蘇氨酸為丙氨酸,或使用GRK5的激酶活性缺失突變體則無(wú)此作用。同時(shí)過表達(dá)GRK5也加快了p53的半衰期,GRK5siRNA處理則相反。這些結(jié)果表明GRK5通過磷酸化p53的55位蘇氨酸加速了p53的泛素-蛋白酶體降解過程。
　　2.GRK5調(diào)節(jié)了p53依賴的細(xì)胞凋亡和G1期阻滯(G1arrest)。我們用順鉑等致DNA損傷藥物處理腫瘤細(xì)胞,分析細(xì)胞凋亡情

8、況后發(fā)現(xiàn),GRK5siRNA處理能夠促進(jìn)DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡,同時(shí)增強(qiáng)p53蛋白水平及下游基因Bax、p21的表達(dá)。過表達(dá)GRK5能在p53+／+腫瘤細(xì)胞系中抑制凋亡,并依賴于其激酶活性。而在p53-／-細(xì)胞系中過表達(dá)GRK5或GRK5K215R對(duì)凋亡沒有明顯影響;只有共轉(zhuǎn)染p53時(shí),GRK5才能明顯抑制凋亡反應(yīng),激酶活性缺失的突變體GRK5K215R則無(wú)此作用,提示GRK5主要通過p53調(diào)節(jié)了凋亡過程,并且依賴于其激酶活性。對(duì)細(xì)胞

9、周期以及細(xì)胞增殖分析的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GRK5siRNA處理促使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期,并抑制細(xì)胞增殖速度;相反,在p53-／-細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染p53與GRK5或GRK5K215R時(shí),轉(zhuǎn)染GRK5的細(xì)胞較激酶活性缺失突變體增殖速度加快,而在突變p53的55位蘇氨酸為丙氨酸后,共轉(zhuǎn)染GRK5或GRK5K215R對(duì)細(xì)胞增殖的影響無(wú)差異。這些結(jié)果提示GRK5通過磷酸化影響了p53促進(jìn)細(xì)胞凋亡和G1期阻滯的生理功能。
　　3.在GRK5基因敲除小鼠

10、中,我們檢測(cè)了包括心臟,肝臟,脾臟,肺、腎臟以及胸腺組織內(nèi)源p53蛋白水平,與對(duì)照組相比p53的蛋白水平,以及p53下游基因Bax的表達(dá)均高于正常小鼠。Γ射線輻射提取胸腺細(xì)胞檢測(cè)凋亡情況,GRK5基因敲除小鼠與對(duì)照組相比明顯提高。這提示GRK5可能在整體水平調(diào)節(jié)了p53的表達(dá)及下游功能。
　　本研究首次證明:1、GRK5能夠特異性結(jié)合p53并磷酸化p53的55位蘇氨酸,從而促進(jìn)p53的泛素化-蛋白酶體途徑降解過程。2、GRK5能夠