C族G蛋白偶聯(lián)受體激活機制的精細研究.pdf

1、C族G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs Family C）(以下簡稱C族受體)包括mGluRs、GABABR、CaSR、TasterR等成員，在體內(nèi)廣泛分布并具有重要的生理功能，其活性受到精密的調(diào)控，并與多種疾病的病理進程密切相關(guān)。除了GPCR所共有的參與G蛋白偶聯(lián)的HD以及膜內(nèi)的C末端，C族受體還具有膜外巨大的參與配體結(jié)合的VFT，以及連接HD與VFT之間的CRD。同時，相對于其他亞家族受配體誘導的不穩(wěn)定的二聚化，C族受體在體內(nèi)形成組成性的二

2、聚體。
　　 可以想見，結(jié)構(gòu)復雜的C族C族受體具有復雜的激活機制。在大量的研究基礎(chǔ)上，簡化的基于單體的兩步激活模型得到了廣泛的承認。配體結(jié)合到VFT后導致VFT 關(guān)閉，進而將激活信號傳導到HD，構(gòu)象發(fā)生改變后的HD與G蛋白偶聯(lián)從而激活受體。
　　 但是，對于這一激活過程中的精細機制，還尚不了解。比如VFT是如何將構(gòu)象變化傳導到HD，CRD在其中所扮演的角色，目前還幾乎是空白。而更重要的是，C族受體在體內(nèi)是組成性的二聚體，

3、對于二聚體在激活過程中復雜的構(gòu)象變化以及由之而產(chǎn)生的各功能域間的相互作用和拓撲學效應(yīng)，簡化的兩步激活模型并不能夠完全解釋。另一方面，功能的重要性和結(jié)構(gòu)上的易操控性，使得C族GPCR成為重要的藥物靶點。因此，對于C族GPCR激活機制的精細研究，在理論和應(yīng)用上都具有重要的意義。
　　 本文研究了異源二聚體GABABR激活過程中的精細機制。我們根據(jù)生物信息學研究推測LB1-LB1結(jié)合界面對于受體的結(jié)構(gòu)形成，以及GABABR的VFT-V

4、FT相互作用具有重要的意義。由此我們根據(jù)構(gòu)建的三維模型在可能的LB1-LB1結(jié)合界面上引入了一系列糖基化位點，進而檢測了突變體的功能變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GB2-N114和GB2-N141失活，并喪失了所有二聚化的生理效應(yīng)；而在同樣位點引入的非糖基化突變GB2-Q114和GB2-Q141則無相應(yīng)改變。這說明引入的糖基化位點所產(chǎn)生的VFT-VFT間的結(jié)構(gòu)阻礙，導致GB1和GB2不能正常二聚化。類似的結(jié)果也在GB1中發(fā)現(xiàn)，位于LB1-LB1結(jié)合界

5、面的GB1-N229和GB1-N251突變具有類似的生理現(xiàn)象。因此，這些結(jié)果探明了GABABR中VFT-VFT相互作用的精細位點，并對GABABR異源二聚化的形成機制提供了新的證據(jù)。我們還將糖基化突變引入到GB2的LB2底部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GB2-N209喪失了活性，但突變體并不影響異源二聚化，據(jù)此推測，該位點的失活與糖基化引入的結(jié)構(gòu)阻礙影響了VFT的構(gòu)象變化以及與HD的偶聯(lián)有關(guān)。
　　 本文在前面工作的基礎(chǔ)上，進一步在CRD中突變了

6、其中嚴格保守的9個Cys殘基。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的突變體均可以正常上膜、二聚化、結(jié)合配體，但其藥物反應(yīng)性質(zhì)均發(fā)生改變，其中mGluR2-C500A產(chǎn)生高組成性活性，mGluR2-C518A激活強度降低，而其余的突變體則完全失活。同時還發(fā)現(xiàn)，上述突變體均可以被PAM所激活。這些結(jié)果證明了CRD參與了VFT-HD之間的偶聯(lián)。利用其他手段我們證實了mGluR2-C500A具有完整的活性，并且其組成性活性依賴于CRD間的二硫鍵的存在

7、，由此推測，其組成性活性可能與VFT和CRD之間的相對位置發(fā)生改變有關(guān)。為了證實這一點，我們進一步在CRD中進行了雙突變體的研究，結(jié)果功能實驗表明，與預測的一致，mGluR2-C500AC519A恢復了配體誘導的激活性質(zhì)；而生物化學研究表明，VFT的C234具有與CRD中的C500、C518、C519間形成二硫鍵的潛力，從而形成不同的構(gòu)象并呈現(xiàn)不同的生理效應(yīng)。類似的結(jié)果在mGluiR4和mGluR5中也得到了驗證。
　　 這些結(jié)

8、果對我們解析CRD的空間結(jié)構(gòu)，以及理解CRD在二聚體激活過程中所發(fā)生的構(gòu)象變化，具有重要的意義。
　　 本文還利用生物信息學的方法研究了C族受體的進化路徑。C族受體的VFT與一些細菌中轉(zhuǎn)運小分子的PBPs具有共同的起源,但不同于PBPs，不同受體的VFT的配體結(jié)合具有高度的專一性。本文運用一種擴展的系統(tǒng)進化分析法，通過比較C族受體中的五種典型成員的VFT，來研究配體結(jié)合的專一性，這種基因/結(jié)構(gòu)復制引起的功能上的趨異變化，是否是由